[发明专利]基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法

权利要求书

1.一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述测序方法是通过使用重元素标记物的单个原子或少量原子对核酸单拷贝序列进行标记，并采用高分辨透射电子显微镜进行成像和结果分析。

2.根据权利要求1所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述核酸单拷贝是指直接从生物细胞或组织中分离纯化所得的核酸产物。

3.根据权利要求1所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述重元素标记物为金、银、铂、钨、汞、铅、铀或具有高原子序数的常见金属及其无机或有机化合物、复合物、螯合物。

4.根据权利要求1所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述重元素标记物的三维特征尺寸小于1纳米，即仅由单原子或数个原子组成，并能够与不同类型的碱基进行特异性结合。

5.根据权利要求1所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述测序方法通过使用高分辨透射电子显微镜的明场、暗场、扫描透射法、高角环形暗场、电子特征X射线能谱、电子能量损失谱、能量过滤成像技术中的一种或两种以上技术的组合体进行成像分析。

6.根据权利要求1所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于： 具体包括以下步骤：

1）单原子标记物溶液的准备：准备3种或3种以上具有不同原子序数的重金属盐溶液；将其稀释后分别与不同的dNTP或其单体的寡聚物溶液反应，得到单原子标记物溶液；

2）待测DNA的寡核苷酸杂交标记：将待测双链DNA的解链后与步骤1）的单原子标记物溶液混合反应，即得到标记DNA样品溶液；

3）TEM样品制备：取步骤2）得到的DNA样品溶液，制备于电镜载网上，得到用于TEM观察的电镜样品；

4）TEM成像：取电镜样品TEM成像即可得到待测DNA片段的序列信息。

7.根据权利要求6所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述重金属盐溶液为硝酸银溶液、高氯酸金溶液、醋酸铀溶液、氯酸铬溶液、醋酸铅溶液、氯化汞溶液、氯化钡溶液和四氧化锇溶液中的3种或3种以上的溶液。

8.根据权利要求6所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述TEM观察的电镜样品的制备方法为：取步骤2）的DNA样品溶液滴于电镜专用铜网上，热风快速干燥或者用50℃以下低温烘烤法得到用于TEM观察的电镜样品。

9.根据权利要求6所述的一种基于高分辨透射电子显微学的单分子DNA测序方法，其特征在于：所述TEM成像模式为将电镜样品在透射电镜下成高分辨明场像直接观察，或以高分辨STEM模式高角环形暗场检测器进行暗场成像；或先成明场像再使用特征X谱图的方式对关注的区域进行特征元素谱图成像；或先成明场像再使用电子能量损失谱谱图的方式对关注的区域进行特征元素谱图成像。