[发明专利]使用鼓泡状接头元件构建测序文库的方法

说明书

一种使用鼓泡状接头元件构建测序文库的方法，采用两个序列不同的鼓泡状接头元件，该鼓泡状接头元件的中间鼓泡结构为不匹配序列，以匹配的测序序列作为PCR引物，通过PCR过程，实现不匹配链的置换；该方法通过一次接头加载及PCR扩增过程就可以保证DNA片段两端连上不同的测序序列，同时实现片段扩增。利用该方法构建测序文库，可进行核酸测序。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种使用鼓泡状接头元件构建测序文库的方法，所构建的测序文库及其应用。

背景技术

全基因组测序技术，是一种广泛覆盖物种全基因组碱基序列，检测个体基因组中全部遗传信息的研究手段。其准确性高，准确率可高达99.99％。随着二代高通量测序技术的发展，测序变得越来越快速、准确、低成本，全基因组测序在研究中得到了越来越广泛的应用。

CG测序是一种基于单链环化DNA的，需要引入已知序列的接头才能进行测序。通常，在构建基于Complete Genomics(CG)测序平台的全基因组文库过程中，标准的CG全基因建库流程，需要分别加两组接头才能完成建库，且每组接头序列不同，加载步骤繁琐，用时较长。

为解决Complete Genomics公司测序平台文库构建中存在的接头连接步骤过多，整体文库构建时间长等问题，特提出了本发明。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种使用鼓泡状接头元件构建测序文库的方法，所构建的测序文库及其应用。本发明通过使用一种鼓泡状接头元件，解决了CG测序平台双接头建库法中存在的接头连接步骤过多、PCR扩增次数多、整体文库构建时间长、成本高的问题，并且提高了建库效率，实现了双接头建库的优化。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

第一方面，本发明提供了一种测序文库的构建方法，该构建方法包括以下步骤：

1)将双链DNA进行片段化，并对所得DNA片段进行平端修复、5’末端磷酸化和3’末端加碱基A；

2)通过连接反应，在步骤1)所得DNA片段两端分别加上接头元件1；所述接头元件1包含一条核酸长链和一条核酸短链；所述核酸长链和核酸短链可退火形成两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体；所述杂交体的核酸长链A的5’末端碱基经磷酸化修饰，所述杂交体的核酸短链B的3’末端带有突出的碱基T；所述接头元件1中具有III类限制性内切酶识别位点；

3)以步骤2)所得DNA片段为模板，以分别针对接头元件1的核酸长链和核酸短链的部分序列的两条序列不同的核酸单链为引物，进行PCR扩增；

所述两条引物的中部具有酶作用位点；优选地，所述酶作用位点为U或dU，对应的酶为USER酶；

4)利用所述酶作用位点，在步骤3)所得扩增片段两端制造粘性末端，利用粘性末端，将扩增片段连接成环状核酸双链；

5)用III类限制性内切酶酶切消化步骤4)所得环状核酸双链，回收酶切后的DNA片段；

6)对步骤5)所得酶切后的DNA片段进行平端修复和3’末端加碱基A；

7)通过连接反应，在步骤6)所得DNA片段两端分别加上接头元件2；所述接头元件2包含一条核酸长链和一条核酸短链；所述核酸长链和核酸短链可退火形成两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体；所述杂交体的核酸长链A的5’末端碱基经磷酸化修饰，所述杂交体的核酸短链B的3’末端带有突出的碱基T；

所述接头元件2的序列不同于接头元件1的序列；

8)以步骤7)所得DNA片段为模板，以分别针对接头元件2的核酸长链和核酸短链的部分序列的两条序列不同的核酸单链为引物，进行PCR扩增；其中一条引物的5’端第一个碱基带有磷酸化修饰，另一条引物的5’端第一个碱基带有生物素标记；