[发明专利]使用鼓泡状接头元件构建测序文库的方法

权利要求书

1.一种测序文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将双链DNA进行片段化，并对所得DNA片段进行平端修复、5’末端磷酸化和3’末端加碱基A；

2)通过连接反应，在步骤1)所得DNA片段两端分别加上接头元件1；所述接头元件1包含一条核酸长链和一条核酸短链；所述核酸长链和核酸短链可退火形成两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体；所述杂交体的核酸长链A的5’末端碱基经磷酸化修饰，所述杂交体的核酸短链B的3’末端带有突出的碱基T；所述接头元件1中具有III类限制性内切酶识别位点；

3)以步骤2)所得DNA片段为模板，以分别针对接头元件1的核酸长链和核酸短链的部分序列的两条序列不同的核酸单链为引物，进行PCR扩增；

所述两条引物的中部具有酶作用位点；

4)利用所述酶作用位点，在步骤3)所得扩增片段两端制造粘性末端，利用粘性末端，将扩增片段连接成环状核酸双链；

5)用III类限制性内切酶酶切消化步骤4)所得环状核酸双链，回收酶切后的DNA片段；

6)对步骤5)所得酶切后的DNA片段进行平端修复和3’末端加碱基A；

7)通过连接反应，在步骤6)所得DNA片段两端分别加上接头元件2；所述接头元件2包含一条核酸长链和一条核酸短链；所述核酸长链和核酸短链可退火形成两端序列互补、中间序列不互补而呈鼓泡状的杂交体；所述杂交体的核酸长链A的5’末端碱基经磷酸化修饰，所述杂交体的核酸短链B的3’末端带有突出的碱基T；

所述接头元件2的序列不同于接头元件1的序列；

8)以步骤7)所得DNA片段为模板，以分别针对接头元件2的核酸长链和核酸短链的部分序列的两条序列不同的核酸单链为引物，进行PCR扩增；其中一条引物的5’端第一个碱基带有磷酸化修饰，另一条引物的5’端第一个碱基带有生物素标记；

9)利用亲和素磁珠回收步骤8)所得PCR产物，并进行变性处理，分离回收非生物素标记的核酸单链；

10)将步骤9)所得非生物素标记的核酸单链进行环化，形成单链环状核酸产物，即为测序文库。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述亲和素磁珠为连霉亲和素磁珠。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述变性处理采用碱变性法或高温变性法。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用介导片段实现所述核酸单链的环化，所述介导片段具有相应互补序列用于连接核酸单链的两端。

5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤10)中，还包括在核酸单链环化完成后，消化线性单链的步骤。

6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，用核酸外切酶1和/或3进行所述消化。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述双链DNA片段是通过如下步骤制备的：

1-1)对mRNA样本进行片段化处理，从而获得片段化的mRNA；

1-2)对所述片段化的mRNA进行反转录，从而获得cDNA扩增产物，作为双链DNA片段。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述双链DNA片段直接由DNA样本进行片段化处理而得。

9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述片段化为利用物理方法或化学方法，对待测DNA进行随机打断或切断。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，利用物理超声法或酶反应法进行待测DNA片段化。

11.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述平端修复是利用T4 DNA聚合酶进行的。

12.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述磷酸化是利用核苷酸激酶进行的。