[发明专利]一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂

说明书

本发明公开了一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂。本发明的方法，包括如下步骤：使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，其中转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头；加入第一试剂进行处理，打破转座酶与核酸的靶序列的吸附作用；加入第二试剂进行处理，减弱第一试剂对后续酶促反应的影响；以第二试剂处理后的产物为模板成分进行PCR反应，得到打断的核酸片段两端连接有接头的PCR产物。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂。

背景技术

自从罗氏发明了焦磷酸测序方法开辟了二代测序以来，直至现在，二代测序经历了一段高速发展期。但随着高通量测序的发展，高通量和低成本的样本制备环节逐渐成了测序领域的一个重点考虑的因素。各种原理的样本处理方法及自动化装置不断被研发出来，主要包括：样本片段化、核酸分子的末端处理及接头连接并最终的出库。

其中样本片段化主要分为物理方法(如超声剪切)或酶学方法(即非特异的核酸内切酶处理)来实现。其中物理方法以基于专利的自适应聚焦超声(Adaptive FocusedAcoustic，AFA)技术的Covaris为主。在等温的条件下，利用几何聚焦声波能量，通过＞400kHz的球面固态超声传感器，将波长为1mm的声波能量聚焦在样品上。该方法确保了核酸样品的完整性得以保留，并能实现高回收率。Covaris的仪器包括经济的M系列、单管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。基于物理方法打断的片段随机性良好，但是通量上也要依赖大量的Covaris打断仪，同时需要后续单独进行末端处理、加接头和PCR以及各种纯化操作。其中酶学方法有一种NEB公司推出的NEB Next dsDNA Fragmentase。该试剂首先在双链DNA产生随机的切刻位点，然后通过另一种酶识别切刻位点来切割互补的DNA链，从而实现打断的目的。这种试剂可以用于基因组DNA、全基因组扩增产物和PCR产物等，随机性也较好，但是会产生一些人工短片段插入和缺失，同时也不可避免的需要后续单独进行末端处理、加接头和PCR以及相应的纯化操作。另外以Epicentra公司(已被Illumina收购)的Nextera试剂盒领衔的转座酶打断试剂盒，利用转座酶同时完成DNA片段化和接头的添加，从而减少样品处理的时间。

从各种操作的简便性来看，转座酶打断的方式无疑在通量及操作简便性上远远胜过其它方法，但是这种打断方式也有自身的缺点：转座酶包埋在靶序列上会抑制后续的酶反应，虽然相关转座酶试剂盒生产商提供了一些试剂用于低起始量(如5ng起始量基因组DNA)样本的转座酶处理，从而实现打断后无需纯化。但是对于50ng起始量这种需要提高转座酶用量的方法，则需要通过过柱或磁珠纯化的方式将转座酶去除，这无疑加大了实验操作的成本和流程(图1A)。

发明内容

本发明提供一种核酸的转座酶打断一站式处理方法及试剂，该方法和试剂能够实现从核酸的转座酶打断到下游的PCR扩增反应的一站式处理，不需要过柱或磁珠纯化，从而简化了实验操作流程并降低实验成本。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种核酸的转座酶打断一站式处理方法，包括如下步骤：

使用转座酶包埋复合体对核酸进行随机打断，其中转座酶包埋复合体包含转座酶和含转座酶识别序列的第一接头；

加入第一试剂进行处理，打破转座酶与核酸的靶序列的吸附作用；

加入第二试剂进行处理，减弱第一试剂对后续酶促反应的影响；

以第二试剂处理后的产物为模板成分进行PCR反应，得到打断的核酸片段两端连接有接头的PCR产物。

在本发明的方法中，采用第一试剂处理转座酶打断核酸后的反应产物，以打破转座酶与核酸的靶序列的吸附作用，替代了传统的流程复杂且成本较高的过柱或磁珠纯化步骤，然后采用第二试剂处理，以减弱第一试剂对后续酶促反应的影响，保证下游的PCR扩增顺利进行。