[发明专利]用于卵巢卵泡生长和成熟的方法

说明书

政府支持

本技术在由National Institutes of Health授予的资助R37-AG012279和F32-AG034809下由美国政府支持完成。美国政府在本技术中具有某些权利。

背景

由小鼠胚胎干细胞（ESC）体外形成的卵泡样结构由单一卵母细胞样细胞组成，其可以生长至直径70 µm大小，由一层或多层紧密附着的体细胞所环绕。与在卵巢内正常卵泡形成过程中所观察到的类似，ESC来源的卵泡样结构内的体细胞经胞间桥与其封闭的生殖细胞连接，其可以用于促进正常卵泡发育所需的细胞与细胞的相互作用。

概述

在一方面，本技术提供促进个体中哺乳动物卵母细胞的生长和成熟的方法。所述方法包括：将哺乳动物多能细胞工程改造以包含颗粒细胞特异性报告分子，其中所述颗粒细胞特异性报告分子的表达指示作为颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞的细胞，将哺乳动物多能细胞在适合于所述多能细胞分化为颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞的条件下体外培养，基于颗粒细胞特异性报告分子的表达分离颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群，并将颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群与哺乳动物卵巢组织接触，其中所述哺乳动物卵巢组织包含卵泡和/或不成熟卵母细胞，其中颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞促进卵泡和/或不成熟卵母细胞的生长和成熟。

在一些实施方案中，颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞的群和哺乳动物卵巢组织是自体的。

在一些实施方案中，哺乳动物卵巢组织是人的。

在一些实施方案中，颗粒细胞特异性报告分子包括在卵巢颗粒细胞特异性基因控制下的荧光报告分子。

在一些实施方案中，卵巢颗粒细胞特异性基因选自：叉头框L2 (Foxl2)、无翼型MMTV整合位点家族成员4 (WNT4)、Nr5a1、Dax-1、ATP-结合盒亚家族9 (Abca9)、乙酰辅酶A酰基转移酶2 (线粒体3-氧代酰基-辅酶A硫解酶; Acaa2)、肌动蛋白α2（平滑肌、主动脉）(Acta2)、具有1型凝血酶基序的解整联蛋白样和金属肽酶（reprolysin样）17 (Adamts17)、ADAMTS-样2 (Adamtsl2)、AF4/FMR2家族成员1 (Aff1)、表达序列AI314831 (AI314831)、醛酮还原酶家族1成员C14 (Akr1c14)、醛酮还原酶家族1、Notch2以及成员C样(Akr1cl)。

在一些实施方案中，荧光报告分子选自：DsRed、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)和橙色荧光蛋白(OFP)。

在一些实施方案中，将颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群与哺乳动物卵巢组织接触先体外后体内（ex vivo）进行。在一些实施方案中，将颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群与哺乳动物卵巢组织接触体内（in vivo）进行。

在一些实施方案中，哺乳动物多能细胞选自：胚胎干细胞（ESC）、诱导多能干细胞（iPSC）、骨髓来源的细胞和外周血来源的细胞。

在另一方面，本技术提供在有需要的个体中提高一种或多种甾体激素水平的方法。所述方法包括：将多个哺乳动物多能细胞工程改造以包含颗粒细胞特异性报告分子，其中所述颗粒细胞特异性报告分子的表达指示作为颗粒细胞或颗粒细胞前体的细胞，将多个哺乳动物多能细胞在适合于所述哺乳动物多能细胞分化为颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞的条件下体外培养，基于颗粒细胞特异性报告分子的表达分离颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群，并将有效量的颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群施用给个体，其中所述颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞分泌一种或多种甾体激素，且其中施用颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群之后，所述个体相比于施用所述颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞经富集的群之前的个体展示出一种或多种甾体激素的水平升高。

在一些实施方案中，所述方法还包括刺激颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞以分泌甾体激素。

在一些实施方案中，甾体激素选自：雌二醇、雌三醇、雌酮、孕烯醇酮和黄体酮。

在一些实施方案中，通过卵泡刺激激素（FSH）、8-溴腺苷3′,5′-环单磷酸 (8-br-cAMP)和黄体化激素（LH）刺激颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞以分泌甾体激素。

在一些实施方案中，颗粒细胞或颗粒细胞前体细胞的群对于个体是自体的。

在一些实施方案中，个体是人。

在一些实施方案中，颗粒细胞特异性报告分子包括在卵巢颗粒细胞特异性基因控制下的荧光报告分子。