[发明专利]引起增强的转录的终止子序列的分离

说明书

本申请要求2013年12月20日提交的61/918828的优先权,在此通过 引文引入该文全部。

发明领域

本发明涉及异源的DNA构建体，其包含引起增强的转录的终止子序 列。

发明背景

植物生物技术的目标是产生具有有利的新特性,例如对虫病的抗性、 对环境应激(例如涝、旱、热、冷、光强度、昼长、化学品等)的抗性、改 善的品质(例如,高果实产量、延长的货架期、均匀的果实外形和颜色、更 高的含糖量、更高的维生素C和A含量、更低的酸度等)的植物,或者是 为了生产某些化学品或药品(Dunwell,2000)。而且能够增强抗非生物性胁 迫(旱、盐)和/或生物性胁迫(昆虫、真菌、线虫感染)的抗性。通过发展具 有理想的表型的基因工程植物，能够实现作物产量的提高和产量的稳定 性。

对于所有的生物技术领域，除了启动子序列之外,位于基因的3′非翻 译区(UTR)中的终止子序列也是特定基因的重组表达所基本必需的。在动 物系统中,转录终止机构已经被很好地确定了(Zhao等人,1999；Proudfoot, 1986；Kim等人,2003；Yonaha和Proudfoot,2000；Cramer等人,2001； Kuerstem和Goodwin,2003)。

然而,终止子可能具有比简单的转录终止更多的效果。例如,由 Narsai等人报道了终止子容纳mRNA稳定化或去稳定化元件(Narsai等 人2007)。在这些元件中可能有富含AU的元件或miRNA结合位点。而 且,有效的终止可以用于释放转录聚合酶而将其再循环回到转录起始位 点。这可以引起更高的转录启动水平(Nagaya等人2010.；Mapendano等人 2010)。在核输出以及随后的转录中也可能涉及mRNA的3′端加工。因 此,终止子序列能够正面地或负面地影响转基因的表达水平。

植物终止子的诱变实验已经鉴定了三个主要的元件:远侧上游元件 (FUE)、近侧上游元件(NUE；AAUAAA-样基序)和切割/聚腺苷酸化位点 (CS)。所述的NUE区是位于所述的聚(A)位点30nt以内的富含A的元件 (Hunt,1994)。所述的FUE区是增强所述CS处的加工效率的富含U或UG 的序列(Mogen等人1990,Rothnie,1996),其本身是在发生聚腺苷酸化的 富含U的区内的YA(CA或UA)二核苷酸(Bassett,2007)。

在植物生物技术中，常常需要以高水平表达转基因以产生所要的效 果。对于大多数应用，启动子的长度被认为主要决定了转基因的表达水 平。启动子的鉴定和表征是昂贵的和费时的，因为每一个启动子都有它 自己的特定表达模式和强度。而且,合适的强启动子的集合是有限的。对于 现代植物生物技术，在一种构建体中针对堆积式多个表达盒的行动，为 了优化基因表达而将相同的强启动子元件加倍承担着同源重组或转录基 因沉默的风险。然而，采用较弱的启动子作为替代来绕过这个问题可能限 制一种基因在所述构建体中的表达。这转而可能对在转基因植物中产生 所要的表型有损害。

代替强启动子,终止子序列可以被用来实现增强在功能上与它们连接 的基因的表达水平。这允许在多基因构建体中使用替代的较弱的启动子 而不损害总的表达水平。另外一个优点可以是:如果仅仅修饰终止子的 话，启动子的特异性和表达模式没有被改变。

因此，本发明的一个目标是提供用来鉴定、分离和测试增强植物中基 因表达的终止子序列的方法。提供增强基因表达的这样的终止子也是本 发明的目标。本发明的另外一个目标是提供有效地终止转录的终止子。

附图的简要描述

图1:终止子1和2以及T-NOS的核酸序列

终止子1(SEQIDNO:1)、终止子2(SEQIDNO:2)和现有技术的终止 子t-nos(SEQIDNO:3)的核酸序列。

图2:在转基因事件中的MUG荧光

在T₀幼苗叶组织中的MUG荧光(平均值±SD)。在多个单拷贝转基 因事件中，每一个条形代表平均活性(n＝12,构建体水平)。以4-甲基伞形 酮的纳摩尔数/分钟/毫克蛋白质来表示活性。

本发明的详细描述