[发明专利]包含使用修饰的单糖化合物的用于特异性标记活菌的方法

说明书

本发明涉及在包含细菌的样品中特异性标记给定类别的革兰氏阴性菌的活菌的方法，所述方法包括步骤：a)将所述样品的所述细菌与至少一种修饰的单糖化合物孵育，所述单糖化合物包含能够与第二反应基团反应的第一反应化学基团，以使带有所述第一反应基团的单糖残基被合并入该细菌的外膜的多糖中，和b)将所述合并入细菌外膜中的修饰的单糖残基与包含所述第二反应基团的标记分子接触。所述修饰的单糖化合物为具有下式(I)的化合物或其盐：其中X可以为O、NH或S，R1、R2和R3可以独立地为H、OH、NH₂、被或不被其保护基取代的OH和NH₂，和R4为H或C₁至C₄的烷基链，每个碳被或不被OH或NH₂取代，所述OH或NH₂被或不被其保护基取代，和X、R1、R2、R3和R4基团中的至少一个被所述第一反应基团R’1取代。

技术领域

本发明涉及用于标记活菌的方法，其包括将修饰的单糖化合物合并入革兰氏阴性菌外膜的多糖(尤其是LPS或CPS)中的物种特异性代谢多糖标记。本发明更特别地提供允许特异性标记尤其是嗜肺军团菌(Legionela pneumophila)的方法，所述方法使用内源性单糖的前体，所述内源性单糖特异性存在于这种细菌的外膜的LPS中。

背景技术

WO 2013/107759公开了标记活菌更特别地是革兰氏阴性菌的方法。所述方法本质上在于通过同化作用将修饰的酮糖酸(ulosonic acid)型单糖化合物的类似物合并入所述细菌的细胞膜中，以使其带有所谓的第一反应化学官能团，如叠氮基(-N₃)或炔基(-C≡CH)，从而使得该第一反应基团能够尤其通过所谓的点击化学反应(click chemistryreaction)与带有互补反应基团的分子反应。

更特别地，在WO 2013/107759中已公开，这种包含酮糖酸或酮糖酸盐(ulosonate)残基的修饰的内源性糖的类似物是特别有利的，因为这样的残基可见于细菌细胞膜的聚糖中，尤其是所有革兰氏阴性菌的LPS中，而且，它们能够以相同的形式被直接同化，其中它们将被合并入所述革兰氏阴性菌的LPS的聚糖中。

酮糖酸(也称为酮糖首酸(ketoaldonic acid)，或首酮糖酸(aldulosonic acid))是酮糖家族的单糖，其在C-2上存在酮官能团，并在C-1上存在羧酸。辛酮糖酸(octulosonicacid)和非酮糖酸(nonulosonic acid)见于多种天然聚糖中，包括不同形式的细菌聚糖(尤其是LPS、荚膜多糖、糖蛋白)中。导致这些聚糖细化(elaboration)的生物合成通路通常涉及作为中间体的游离酮糖酸，其然后以CMP-糖供体的形式被直接激活。所有革兰氏阴性菌的LPS都包含所述酮糖酸残基。

更准确地，WO 2013/107759中公开的方法为在包含细菌的样品中特异性标记给定类别的细菌的活菌的方法，所述方法包括步骤：

a)将所述样品的所述细菌和至少一种单糖化合物的类似物孵育，所述单糖为该给定类别的细菌的外膜聚糖的内源性单糖残基，所述内源性单糖残基包含酮糖酸或酮糖酸盐残基，所述单糖化合物的类似物为在给定位置被第一反应化学基团取代的修饰的单糖，所述第一反应化学基团能够与标记分子的第二反应基团反应，和

b)将所述细菌与包含所述第二反应基团的所述标记分子接触，以产生合并入所述活菌的所述外膜聚糖中的所述类似物残基的所述第一反应基团与所述标记分子的所述第二反应基团的反应。

特别地，在WO 2013/107759中，所述单糖类似物为具有下式(I’)之一的取代酮糖酸或其酮糖酸盐：

其中

-A、B和C可以独立地为H、OH、NH₂、被或不被其保护基取代的OH和NH₂，和

-D为C₂至C₄的烷基链，和