[发明专利]用于插入核酸的载体

说明书

本发明提供：一种载体，其用于在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、规定部位和由第2核苷酸序列构成的区的核酸的上述规定部位插入所期望的核酸，该载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区；包含该载体的试剂盒；核酸的插入方法，该方法包括向细胞中导入该载体的步骤；通过该方法获得的细胞；以及包含该细胞的生物。

技术领域

本发明涉及用于在细胞内的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法、以及用于该目的的载体、试剂盒、和通过该方法获得的细胞。而且，本发明还涉及含有包含所期望的核酸的细胞的生物、及其制备方法。

背景技术

作为包含多个由DNA结合结构域和DNA剪切结构域构成的核酸酶亚基(亚单位)的多肽，已知有TALEN(TALE核酸酶(TALE Nuclease))或ZFN(锌指核酸酶(Zinc FingerNuclease))等(专利文献1～4、非专利文献1)。这些人工核酸酶在DNA结合结构域的结合部位因多个DNA剪切结构域接近形成多聚体而引起DNA的双链剪切。DNA结合结构域重复包含多个DNA结合模块，各DNA结合模块识别DNA链中的特定碱基对。因此，通过适当设计DNA结合模块，可以在特定的核苷酸序列中进行特异性剪切。作为在特定的核苷酸序列中进行特异性剪切的其他核酸酶，已知有CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶(非专利文献2)、或使CRISPR/Cas系统与FokI核酸酶融合得到的RNA诱导型FokI核酸酶(FokI-dCas9)(非专利文献3)。通过利用在修复由这些核酸酶进行的剪切时产生的错误或重组，进行基因组DNA上的基因的缺失、插入和突变导入等各种基因修饰(参照专利文献5～6、非专利文献4)。

作为利用人工核酸酶在细胞中插入所期望的核酸的方法，已知有非专利文献5～8中记载的方法。非专利文献5中记载着：利用TALEN通过同源重组插入外来DNA的方法。另外，非专利文献6中记载着：利用ZFN通过同源重组插入外来DNA的方法。但是，利用同源重组的载体无法简便地制作成长链。另外，根据细胞或生物种，有时同源重组效率低，因此这些方法只能用于有限的细胞和生物种。为了获得稳定具有插入了所期望的核酸的细胞的改良生物，向动物胚胎中导入目标核酸后使胚胎分化而获得成体是有效的，但在动物胚胎中同源重组效率低，这些方法没有效率。作为向动物胚胎中导入外来性DNA的技术，已知有ssODN介导的基因修饰，但在该技术中只能导入约数10bp左右的短DNA。

非专利文献7和8中记载的方法是不利用同源重组、而利用人工核酸酶向细胞中插入核酸的方法。非专利文献7公开了下述方法：利用ZFN和TALEN剪切细胞内的核酸和应该插入的外来DNA，利用非同源末端结合(NHEJ)的作用连接两者的剪切部位，从而插入外来DNA。但是，在非专利文献7所记载的方法中，无法控制所插入的核酸的方向，所插入的核酸的连接点也不正确。非专利文献8所记载的方法是使通过核酸酶的剪切由细胞内的核酸产生的单链末端和由外来性DNA产生的单链末端相互退火后再进行连接，以能够控制方向和进行正确的连接。但是，非专利文献8所记载的方法中，为了防止对插入后的DNA再次进行剪切，必须使用异源二聚体型的ZFN和TALEN，而无法使用活性高的同源二聚体型人工核酸酶。另外，非专利文献8所记载的方法不用于向动物胚胎中插入所期望的核酸。而且，非专利文献8所记载的方法中，使单链末端在错误位点退火的发生频率高，而获得接受了正确插入的细胞的频率不高。需要说明的是，非专利文献5～8中没有记载使用CRISPR/Cas系统等的RNA诱导型核酸酶或FokI-dCas9等的RNA诱导型FokI核酸酶的方法。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：国际公开第2011/072246号；

专利文献2：国际公开第2011/154393号；

专利文献3：国际公开第2011/159369号；

专利文献4：国际公开第2012/093833号；