[发明专利]用于插入核酸的载体

权利要求书

1.载体在生物体外用于通过核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法中的应用，

其中，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，

上述核酸酶对上述细胞所含的包含上述由第1核苷酸序列构成的区和上述由第2核苷酸序列构成的区的部分进行特异性剪切，

上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区，

上述载体通过上述核酸酶产生在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段，

上述细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，上述细胞所含的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，由此插入上述所期望的核酸。

2.载体在生物体外用于通过包含第1 DNA结合结构域和第2 DNA结合结构域的核酸酶在细胞所含的核酸中的规定部位插入所期望的核酸的方法中的应用，

其中，上述细胞所含的核酸在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区，

在上述细胞所含的核酸中，由第1核苷酸序列构成的区、上述规定部位和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间，

其中，上述载体在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区，

在上述载体中，由第1核苷酸序列构成的区和由第2核苷酸序列构成的区分别位于由通过第1 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区和由通过第2 DNA结合结构域识别的核苷酸序列构成的区之间，

上述载体通过上述核酸酶产生在从5’末端到3’末端的方向依次包含由第1核苷酸序列构成的区、上述所期望的核酸和由第2核苷酸序列构成的区的核酸片段，

上述细胞所含的核酸中的第1核苷酸序列和上述载体中的第1核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，上述细胞所含的核酸中的第2核苷酸序列和上述载体中的第2核苷酸序列通过微同源介导的结合来连接，由此插入上述所期望的核酸。

3.权利要求2所述的应用，其中，上述核酸酶为同源二聚体型的核酸酶，上述载体为环状载体。

4.权利要求1所述的应用，其中，核酸酶为Cas9核酸酶。

5.权利要求2所述的应用，其中，核酸酶为TALEN。

6.权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，第1核苷酸序列为3个核苷酸长度～10个核苷酸长度，并且第2核苷酸序列为3个核苷酸长度～10个核苷酸长度。