[发明专利]表达构建体和用于表达真核细胞中的多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及表达构建体和使用可变剪接表达真核细胞中的多肽和/或多肽多 聚体的方法。包括用于产生含有这些构建体的宿主细胞的方法，以及这些构建 体以及从其表达的多肽在高效产生蛋白质方面的用途。

背景技术

为了在真核细胞中产生蛋白质，必须将编码这种蛋白质的DNA转录成信使 RNA(mRNA)，所述信使RNA将转而被翻译成蛋白质。mRNA首先在细胞核 中作为含有内含子和外显子的前mRNA被转录。在前mRNA成熟为成熟的 mRNA的过程中，内含子由称为剪接体的蛋白质机械切出(“剪接”)。外显子被 融合在一起并且mRNA通过在其5'端加入所谓的CAP和在其3'端加入多(A)尾 而被修饰。成熟的mRNA被输出到细胞质并充当在其中编码的蛋白质的翻译的 模板。

可变剪接是描述其中相同的前mRNA转录可能以不同的方式剪接从而导致 不同的成熟mRNA并在某些情况下导致不同的蛋白质的现象的术语。这种机制 本质上用于改变蛋白质的表达水平或者为了在发育期间修饰特定蛋白质的活性 (CooperTA&OrdahlCP(1985),JBiolChem,260(20):11140-8)。可变剪接通常 由多种因素的复杂的相互作用控制(OrengoJPetal.,(2006)NucleicAcidsRes, 34(22):e148)。

虽然剪接在文献中是众所周知的并且共有序列已经被发表用于人类细胞中 的剪接，但是由于可能影响剪接的多种因素，不容易预测可变剪接事件的精确 结果。已知影响剪接的因素包括分支点的共有序列、剪接供体和剪接受体区域、 外显子和内含子的大小以及导致剪接增加或减少的对调节蛋白的结合位点(参 见AlbertsB等人(2002)MolecularBiologyoftheCell，第4版，纽约：Garland Science)。

可以使用可变剪接以便增加多肽，特别是多聚体蛋白质例如抗体的表达水 平。抗体表达的水平取决于重链与轻链表达的比率。虽然文献表明，相比于重 链，有利于表达更多轻链(DoraiH等人，(2006)Hybridoma(Larchmt),25(1):1-9)， 本申请人已经确定导致最大表达的轻链与重链最佳比率在很大程度上取决于抗 体。这同样适用于双特异性抗体，其中，本发明人已经表明，抗体表达水平取 决于形成双特异性抗体的不同链的比率。

本领域先前已经描述了使用可变剪接表达宿主细胞中的多肽的方法。例如， Prentice(WO200589285)描述了这样的表达载体，其包括在单一启动子的控制 下的两个或多个表达盒，其中表达盒具有允许它们的可变剪接的剪接位点。在 这个构建体中，在每个开放阅读框后包含多多腺苷酸化(多聚(A))位点。类似地， Fallot等人(WO2007135515)也描述了一种表达盒，其可以使用单一启动子在 宿主细胞中表达以驱动前mRNA的转录，所述前mRNA可剪接成两个或多个 mRNA以用于随后的多肽表达。该表达盒包括位于其3'端的多腺苷酸化信号， 其根据本申请人所说，避免涉及剪接位点和转录终止进程之间的竞争的任何附 加规定。此外，可操作地连接到选择标记的IRES也包括在3'多腺苷酸化信号之 前以便能够选择稳定的细胞系。来自Lucas等人的替代构建体(NucleicAcids Research,1996,24(9):1774-9)仅包括一个内含子，一个剪接供体和一个剪接受 体位点，其中所述内含子被剪接或未被剪接。

可以使用可变剪接以便以导致最高滴度的比率表达抗体所需的亚单位。例 如，在相同的构建体上克隆重链和轻链。剪接将导致表达重链或轻链的mRNA 的特定比率。可以将该比率调节为接近用于表达最终抗体的最佳值。在产生双 特异性分子时比率可能不仅影响表达水平，而且还影响产物质量。可通过查看 目的产物种类的最高表达来鉴别最佳比率。选择具有最小的副产物产生的比率 也可能是有益的。

发明内容