[发明专利]包含重组人凝血因子Xa蛋白的异质性群体的组合物

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求2013年9月24日提交的美国临时申请号61/881,834(其全文以引用方 式并入本文)的权益。

序列表的参考

根据37CFR§1.821，以计算机可读形式(CRF)经由EFS-Web随本文同时提交的文件 名为PC72049_SEQLIST_ST25.txt的序列表以引用方式并入本文。所述序列表的电子复本在 2014年9月10日创建，文件大小为31千字节。

发明背景

对于能够在一系列其中无法通过医疗或外科干预适当地控制出血的临床病况中 控制过量出血的有效疗法是有需求的。此种未被满足的需求在患有血友病的患者，尤其是 在那些由于产生抑制性抗体而使因子替代疗法的有效性减小的患者中是特别关键的。

经活化的凝血因子X(FXa)在内因性和外因性凝血通路会聚处的凝血级联中占据 中心位置。与膜结合的FXa在其辅因子Va(FVa)的存在下将凝血酶原转化成凝血酶，该凝血 酶活化血小板并将纤维蛋白原转化成纤维蛋白以形成血栓。原则上，直接施用FXa的替代疗 法可以矫正出血。然而，由于FXa的血浆半衰期非常短且可能因其它凝血因子的活化而引起 过度凝血，所以其治疗潜力受到限制。

早期的工作鉴定出一种FXa变体(I16L变体)，其中亮氨酸取代野生型FXa重链的氨 基末端处的异亮氨酸(在胰凝乳蛋白酶编号方案中的位置16)。所述取代产生具有酶原样特 征的FXa变体。Toso,R.等人，TheconformationalswitchfromthefactorXzymogen toproteasestatemediatesexositeexpressionandprothrombinase assembly.J.Biol.Chem.283.18627-18635(2008)；IvanciuL.等人，Azymogen-like factorXavariantcorrectsthecoagulationdefectin hemophilia.Nat.Biotechnol.29:1028-33(2011)。

当不与其辅因子Va(FVa)掺入凝血酶原酶复合物中时，FXaI16L变体不具有显著 的催化活性并且与野生型FXa相比，受到较好的保护而免于被血清蛋白酶抑制剂去活化。因 此，与野生型FXa相比，该变体具有较长的血清半衰期。然而，与凝血酶原酶中的FVa结合导 致该变体从酶原样状态转换至活性构象，从而恢复该变体催化凝血酶原转化成凝血酶的能 力并从而恢复其促凝血活性。在血友病A和血友病B的小鼠模型中，在受伤前施用FXaI16L 变体在截割尾巴后以剂量依赖方式减少失血。这些实验的结果表明FXaI16L变体可用于治 疗人血友病患者中不受控制的出血。

然而，在早期研究中所使用的FXaI16L变体从经稳定转染的HEK293细胞小量制 造，再使用鲁塞尔氏蝰蛇毒蛋白酶(Russell'svipervenomprotease)RVVX活化FX蛋白。 Toso,R.,Zhu,H.&Camire,R.M.TheconformationalswitchfromthefactorXzymogen toproteasestatemediatesexositeexpressionandprothrombinase assembly.J.Biol.Chem.283,18627-18635(2008)。虽然对于小规模的研究是有用的，但此 方法不适合用于大量制造临床研究和最终供给病人所需的经纯化的FXa变体蛋白。因此，本 领域需要制备FXaI16L变体蛋白，所制造的量和纯度使FXaI16L变体蛋白可在临床试验中 进行测试且被批准后可提供给需要止血的受试者。

发明概述

本公开内容通过提供FXa变体蛋白的组合物来解决上述本领域中未被满足的需 求，所述FXa变体蛋白以足够的纯度和数量制造而能提供给需要止血的受试者。在多个实施 方案中，这些组合物包含FXa变体蛋白的不同的同工型和翻译后修饰。