[发明专利]高表达发酵单胞菌启动子

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。更具体地，鉴定了用于引导细 菌中嵌合基因表达的新型启动子。

背景技术

微生物的乙醇生产提供了化石燃料的替代性能源且因此成为当前研究 的重要领域。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)是可用于商业乙醇生 产的天然产乙醇生物。然而，运动发酵单胞菌天然情况下并不利用木糖， 其为水解木质纤维素物质中主要的戊糖。人们希望产乙醇生物利用木糖以 充分利用木质纤维素生物质材料水解物中的碳水化合物底物。

运动发酵单胞菌和天然情况下不利用木糖的其它产乙醇生物可通过引入 基因来进行针对木糖的基因工程，所述基因编码1)木糖异构酶，其催化木 糖至木酮糖的转化；2)木酮糖激酶，其使木酮糖磷酸化以形成木酮糖-5-磷 酸；3)转酮醇酶；和4)转醛醇酶。针对木糖代谢对运动发酵单胞菌菌株的 工程化(US5,514,583，US5,712,133，US6,566,107，US5,726,053，Feldmann等 人(1992)ApplMicrobiolBiotechnol38：354-361，Zhang等人(1995)Science 267：240-243)，以及对棕榈发酵杆菌(Zymobacterpalmae)菌株的工程化 (Yanase等人(2007)Appl.Environ.Mirobiol.73：2592-2599)已有成功。然 而，工程化的菌株在木糖上的生长以及产生乙醇通常不如葡萄糖一样良好。

对这种工程化，已通过在运动发酵单胞菌细胞中有活性的启动子来表 达编码用于木糖代谢的异源蛋白质的基因，所述启动子通常为运动发酵单 胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子或运动发酵单胞菌烯醇酶基因的启 动子。针对木糖利用进行工程化的菌株已经通过在木糖培养基上连续传代 而进行驯化，产生了具有改善的木糖利用的菌株，如US7223575和US 7741119中所述。US7989206和US7998722公开了具有改善活性的运动发 酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子以及其在发酵单胞菌 (Zymomonas)中表达木糖异构酶用于木糖利用的用途。

对于另外的强启动子依然有需求，所述另外的强启动子可用于对发酵 单胞菌以及其它产乙醇生物的基因工程以表达赋予改善的木糖利用的基 因。所述启动子还可用于其它基因的表达。

发明内容

本发明提供了具有改善活性的合成启动子，其为运动发酵单胞菌甘油 醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子的衍生物。

因此，本发明提供了合成的核酸分子，其包含具有在位置90处T对C 的碱基取代的运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子；其中所述 位置编号属于SEQIDNO：1。与天然运动发酵单胞菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶 基因启动子相比，这一碱基取代具有增加所述启动子强度的效果。

在其它方面，本发明提供了包含合成的核酸分子的嵌合基因以及包含 其的载体，所述合成的核酸分子具有上述碱基取代。

在另外的方面，本发明提供了转化细菌细胞的方法，所述细菌细胞选 自发酵单胞菌细胞和发酵杆菌(Zymobacter)细胞，所述方法包括将本发 明的合成核酸分子引入到所述细胞中。

在另一方面，本发明提供了包含本发明的合成核酸分子的重组细菌菌 株，所述重组细菌菌株选自发酵单胞菌和发酵杆菌。

在另一个实施例中，本发明提供用于生产改善的合成甘油醛-3-磷酸脱 氢酶基因启动子的方法，该方法包括：

a)从来自发酵单胞菌和发酵杆菌的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因分离包 含甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子区域的核酸片段；

b)将在位置90处T对C的碱基取代引入到a)的分离片段，从而产 生改善的合成甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子。

附图说明和序列描述

图1示出了pZP13的质粒图谱。

根据下面的详细描述以及构成本申请一部分的附带的序列描述可更充 分地理解本发明。