[发明专利]应用寡聚体dT分子来避免生成由多聚A载运体诱导的高分子量PCR产物

说明书

在RNA分离期间，使用载运体核酸如多聚A‑RNA以增加分离的RNA的收率。所述载运体核酸可能产生高分子量产物，其可能干扰后续步骤如逆转录、PCR和凝胶电泳。本发明因此涉及用于逆转录的方法和试剂盒以及封闭性核酸分子用来封闭载运体多聚A‑RNA的用途。

发明背景

在RNA分离期间，使用载运体(carrier)核酸如多聚A-RNA(polyA-RNA)以增加分离的RNA的收量(yield)。所述载运体核酸可能产生高分子量产物，其可能干扰后续步骤如逆转录、PCR和凝胶电泳。本发明因此涉及用于逆转录的方法和试剂盒以及封闭性核酸分子(blocking nucleic acid)用来封闭载运体多聚A-RNA的用途。

将少量病毒RNA分离出血浆需要一种确保RNA的低损失率的方法，这是对病毒基因组的进一步分析所需要的。可使用不同方法分离病毒RNA。一种最常见的方法是手动RNA分离。对于大多通过基于柱的方法进行的血浆中的手动RNA分离，使用载运体RNA，像多聚A、MS2RNA或tRNA来抑制靶RNA对柱材料的不可逆结合。另外，已显示合成的多聚A载运体RNA增强RNA对分离柱中二氧化硅(sliica)表面的可逆结合，这也导致增加的RNA收量(DN.Hengen等,Trends of Biochemical Sciences 1996,21,224-225；ML.Gallagher等Biochemicaland Biophysical Research Communications 1987,144,271-276)。载运体RNA封闭柱材料，从而可将靶RNA定量分离出血浆样品。使用载运体RNA还可具有另外的有益效果，如改进靶RNA稳定性(D.Andreasen等,Methods 2010,50,S6-S9；R.Kishore等,J.Forensic.Sci.2006,51(5),1055-1061)。

在分离后，实施RNA的逆转录以生成cDNA用于后续PCR反应。将多聚A-RNA作为RNA载运体用于分离步骤和将随机六聚体引物用于逆转录步骤，在PCR反应期间产生不想要的非特异性的高分子量产物，其来自多聚A-RNA分子和能结合多聚A-RNA的随机六聚体引物的一部分的杂交。然后，该高分子量杂交产物在PCR期间扩增，其在琼脂糖凝胶上可见为高分子量(HMW)拖尾带(smear)。HMW产物的生成最终导致更低量的扩增的靶DNA。

因此，本说明书的目的是提供不显示上述缺点的方法。

发明概述

发现如果通过在3’端封闭的寡聚体dT分子(oligo-dT molecules)来封闭用作载运体的多聚A-RNA，则可以防止上文描述的HMW产物，该产物不利地影响逆转录后的规程。

因此，本说明书涉及逆转录方法，其中所述方法包括以下步骤：a)提供包含RNA的样品，b)使所述样品与载运体核酸接触，由此生成混合物，c)在如下条件下将该混合物施加到基质，该条件使得发生所述RNA和所述载运体核酸对所述基质的结合，d)将所述基质与所述混合物分离，所述基质具有结合于该基质的所述RNA和所述载运体核酸，e)从所述基质洗脱所述RNA和所述载运体核酸，由此产生洗脱物，f)在如下条件下向所述洗脱物添加封闭性核酸，该条件使得发生所述封闭性核酸对所述载运体核酸的杂交，g)在如下条件下向来自步骤f)的洗脱物添加引物，该条件使得发生所述引物对所述RNA的杂交，和h)将所述RNA逆转录成cDNA。

在一个具体的实施方案中，所述载运体核酸是RNA载运体。在一个更具体的实施方案中，所述RNA载运体是多聚A-RNA。

在一个具体的实施方案中，所述封闭性核酸是寡聚体dT分子。在一个更具体的实施方案中，所述寡聚体dT分子是5’-(dT)n-X-3’，其中所述(dT)n是n聚体同型2’-脱氧-胸苷寡核苷酸，其中所述n是18、19、20、21或22，其中所述X选自下组：p、pC3、pC3p、pC3pC3和pC3pC3p，且其中X结合于(dT)n的3’末端羟基基团且其中p是磷酸根和C3是1,3-丙二醇间隔物。在一个甚至更具体的实施方案中，n是20且X是pC3pC3p。