[发明专利]用于基因转移到细胞、器官和组织中的变异AAV和组合物、方法及用途

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年4月28日提交的美国临时申请No.61/985365和2013年7月22日 提交的美国临时申请No.61/857161的优先权，所有这些申请在此通过引用整体并入本文。

技术领域

由于所希望的基因不存在或其缺陷(功能丧失)或者不希望有的或有缺陷的基因 的表达或者(功能增加)引起的遗传病导致多种疾病。功能丢失基因病症的一个示例是血友 病，一种由凝血因子VIII(FVIII，A型血友病)或因子IX(FIX，B型血友病)缺乏造成的遗传性 出血性疾病。功能增加的遗传病症的一个示例是亨廷顿病，一种由编码特别是基底神经节 和大脑皮层中累积的突变蛋白并导致神经元逐渐破坏的病理性“HTT”基因(编码亨廷顿蛋 白)引起的疾病。

当前治疗血友病在于根据需要、在发生出血的情况下或预防性地静脉内施用重组 凝血因子。然而，这种治疗方法有几个缺点，例如需要反复输注、治疗成本、发生抗治疗因子 免疫反应的风险以及潜在的致命性出血的风险。这些限制已促使开发基于基因的血友病治 疗。为此，血友病对基于基因转移的治疗是理想的，因为：1)治疗窗很宽，因为刚刚高于正常 值1％的水平已经可导致表型从严重变至中度，并且100％的水平与任意副作用均不相关； 2)治疗性转基因的组织特异性表达要求不严格；以及3)在测量治疗功效的终点方面具有相 当多的经验。此外，凝血因子的肝表达已被证实诱导对凝血因子本身的免疫耐受性，从而降 低了针对凝血因子的潜在的有害的免疫反应的可能性。

目前，腺相关病毒(AAV)载体被认为是选择的基因转移载体，因为它们对基因在体 内的递送具有最佳的安全性和疗效性能。在目前为止所分离的AAV血清型中，AAV2和AAV8已 被用于靶向患有严重B型血友病的人类肝脏。两种载体均有效地工作，并且记录了治疗性转 基因的AAV8长期表达的情况。人类的最近的数据表明，利用AAV载体靶向肝脏实现治疗水平 的FIX转基因长期表达。

尽管这些数据是有价值的，但是在人类(野生型AAV的天然宿主)中对肝脏具有高 取向的AAV血清型和低血清阳性率的识别基本上用于1)以最低的载体剂量在肝脏中实现治 疗水平的转基因表达以降低触发抗AAV衣壳免疫应答的风险；和2)交替具有独特的血清阳 性率的AAV血清将允许治疗那些由于预先存在的抗AAV体液免疫而不符合AAV基因转移的患 者群体。本发明解决这些需求并提供其他的益处。

发明内容

本发明提供了腺相关病毒(AAV)血清型AAV-Rh74载体以及相关的AAV载体和病毒 颗粒。除其他的类型之外，这样的载体尤其包括靶向肝脏的肝细胞的AAV-Rh74。作为多核苷 酸序列递送的载体，AAV-Rh74和相关的AAV载体驱动多核苷酸在细胞中表达。编码蛋白质例 如用于治疗应用的蛋白质的多核苷酸能在施用后以治疗水平进行表达。

示例性的AAV-Rh74和相关的AAV载体包括AAV-Rh74变体。具体的衣壳变体包括在 RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的195、199、201或202氨基酸位中的任一个上具有氨基酸 替代(substitution)的Rh74衣壳序列。在具体的方面，所述残基对应于RH74VP1衣壳序列 (SEQIDNO:1)的195、199、201或202氨基酸位中的任一个上的A、V、P或N氨基酸。在更具体 的方面，所述衣壳序列具有在RH74VP1衣壳序列(SEQIDNO:1)的第195氨基酸位的A残基； 第199氨基酸位的V残基，第201氨基酸位的P残基，或第202氨基酸位的N残基。在进一步更具 体的方面，所述衣壳序列具有以下的任意两个、三个或全部四个：在RH74VP1衣壳序列(SEQ IDNO:1)的第195氨基酸位的A残基；第199氨基酸位的V残基，第201氨基酸位的P残基，或第 202氨基酸位的N残基。