[发明专利]包含二级结构的寡核苷酸及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及寡核苷酸，并尤其涉及它们作为探针在使用可检测标记物(例 如目视可检测的标记物)检测杂交事件和检测和/或区分核酸中的用途。

背景技术

基于用可检测标记物(例如荧光团)标记的寡核苷酸的探针技术，尤其以 荧光团作为5’磷酸末端处添加物的探针技术已经建立已久。这种末端标记价 廉，并且因此这类探针的开发和应用广泛遍及各种分子生物学应用。相比之 下，其中多个荧光团可以与寡核苷酸序列内部的核苷碱基或糖连接(即内部标 记)的优化探针设计，例如HyBeacon探针(Frenchetal,(2001)、WO01/73118、 WO07/010268)应用并不广泛，原因在于这类内部荧光团添加本身更为昂贵。 在末端标记的寡核苷酸中，通常还需要存在单独的淬灭物分子，以防止在寡 核苷酸与靶多核苷酸杂交前的信号。内部标记的寡核苷酸(例如WO 01/73118、WO07/010268中描述的那些)通常不需要单独淬灭物的存在，原 因是寡核苷酸探针的单链序列作为标记物的淬灭物(DNA淬灭)而发挥作用。

建立已久的使用标记核酸寡核苷酸作为靶核酸序列(DNA或RNA)存在 的报道分子的领域利用了基于寡核苷酸的探针与其靶核酸序列的直接核苷酸 序列互补性，以及其与基因组背景相比足够的共有序列所实现的唯一匹配。

寡核苷酸与核酸序列的杂交消除了DNA淬灭和染料-染料相互作用，并 且引起荧光发射的增加(WO01/73118、WO07/010268)。荧光发射的变化使 得可以检测特异的核酸序列，探针和靶之间相互作用的稳定性，使得可以基 于长度和序列区分多态性序列(Frenchetal.2001,Frenchetal.2002,Frenchet al.2007,Frenchetal.2008)。

除非需要获得与探针-靶相互作用并存的特定的额外分子端点，否则没必 要刻意使用部分序列互补性或使用在探针及其靶之间提供媒介杂交事件的额 外寡核苷酸。

在荧光寡核苷酸探针的例子中，常规探针-靶杂交配对中发现的直接序列 互补性的重要增量收益在于，靶中的任何序列变异(如单核苷酸多态性(SNP)) 直接破坏了这种杂交并且因此直接破坏了探针的荧光输出。

主要地，已知寡核苷酸探针中的DNA茎环序列可用于信号生成和靶检 测，从而使得在寡核苷酸与靶多核苷酸杂交时，茎环结构消失(即寡核苷酸不 再具有二级结构)。

“分子信标”是形成茎环结构的单链寡核苷酸(Tyagi&Kramer,1996； Tyagietal.1998)。茎包括位于探测序列任一侧的两条互补的核酸序列。茎序 列之一通常用荧光团标记，另一条通常用非荧光淬灭物标记。茎环结构使荧 光团和淬灭物部分紧密靠近，从而充分淬灭荧光发射。分子信标寡核苷酸的 环组件与靶核酸互补，并且杂交引起茎环解离，原因是分子间的探针/靶杂交 比寡核苷酸茎序列之间的分子内相互作用更稳定。荧光团和淬灭标记物在探 针杂交时由于茎环结构的解离而分离，这导致信号发射增加。分子信标寡核 苷酸可用于实时PCR和解链曲线分析。

与分子信标类似，Knemeyeretal.(2000)描述了这样的寡核苷酸(Smart 探针(Smartprobes))，所述寡核苷酸具有茎环结构，但却通过光诱导的分子 内电子转移至一条寡核苷酸茎序列内的鸟嘌呤残基而实现了荧光淬灭。连接 在一条寡核苷酸茎序列末端的荧光团(例如噁嗪染料JA242)与发夹的互补茎 序列中的富含G序列紧密靠近。探针与靶序列的杂交将荧光团与富含G序列 分开，从而导致荧光增强。

Scorpion^TM引物包含位于茎环结构内部的探测序列，其具有位于探测序 列任一侧的互补茎序列(Whitcombeetal.1999；Thelwelletal.2000)。连接至寡 核苷酸5’末端的荧光团部分被连接至茎环的3’末端的内部淬灭物修饰所淬 灭。茎环序列通过PCR制止物(例如六乙二醇(HEG))而与PCR引物的5’末端 连接。引物组件的延伸产生了用于寡核苷酸的探测组件的靶序列。与所扩增 的靶的分子内探针杂交引起了茎环结构的解离以及荧光发射的增加。

分子信标、Smart探针和Scorpion^TM引物利用了具有位于探测序列的两 个末端的茎序列的发夹结构。环与靶多核苷酸结合，但茎序列不与靶相互作 用。