[发明专利]包含二级结构的寡核苷酸及其用途

权利要求书

1.具有5’末端和3’末端的单链寡核苷酸，所述寡核苷酸包含第一区段和 第二区段，第一区段位于第二区段的5’，其中：

(i)第一区段用至少两个可检测标记物标记并且能够与靶多核苷酸杂交； 并且

(ii)第二区段不能与靶多核苷酸杂交；所述第二区段包含含有第一部分、 第二部分和第三部分的茎环结构，并且其中第二部分位于第一部分和第三部 分之间，第一部分和第三部分彼此互补，其中，所述茎环结构没有用可检测 的标记物标记；

并且，进一步地，其中，在用于检测靶多核苷酸的方法中时，所述寡核 苷酸(a)不被3’-5’核酸外切酶切割且(b)不被聚合酶延伸。

2.检测感兴趣样品中靶多核苷酸的存在和/或靶多核苷酸内部序列变异 的存在的方法，包括步骤：

(i)提供具有5’末端和3’末端的单链寡核苷酸，所述寡核苷酸包含第一区 段和第二区段，第一区段位于第二区段的5’末端；并且其中：

第一区段用至少两个可检测标记物标记并且能够与靶多核苷酸杂交；并 且

第二区段不能与靶多核苷酸杂交；所述第二区段包含含有第一部分、第 二部分和第三部分的茎环结构，并且其中第二部分位于第一部分和第三部分 之间，第一部分和第三部分彼此互补，并且其中，所述茎环结构没有用可检 测的标记物标记；

(ii)使所述感兴趣的样品暴露于(i)的寡核苷酸；

(iii)检测可检测标记物中的变化，其中可检测标记物中的变化表明靶多核 苷酸的存在和/或靶多核苷酸内部序列变异的存在。

3.权利要求1所述的寡核苷酸或权利要求2所述的方法，其中，所述可 检测标记物是目视可检测的标记物。

4.权利要求1或3所述的寡核苷酸或权利要求2或3所述的方法，其中， 第一区段用所述至少两种可检测标记物内部标记。

5.权利要求1、3或4所述的寡核苷酸或权利要求2至4任一项所述的 方法，其中所述至少两种可检测标记物是相同的。

6.权利要求1或权利要求3至5任一项所述的寡核苷酸或权利要求2至 5任一项所述的方法，其中，所述可检测标记物在没有相连的淬灭物的情况 下存在。

7.权利要求1或权利要求3至6任一项所述的寡核苷酸或权利要求2至 6任一项所述的方法，其中，第二区段不能与第一区段杂交。

8.权利要求1或权利要求3至7任一项所述的寡核苷酸或权利要求2至 7任一项所述的方法，其中，在所述寡核苷酸与所述靶多核苷酸杂交时，所 述茎环结构不解离。

9.权利要求1或权利要求3至8任一项所述的寡核苷酸或权利要求2至 8任一项所述的方法，其中，第一区段的长度在15至40个核苷酸残基之间 或在18至30个核苷酸残基之间；和/或第二区段的长度在7至40个核苷酸 残基之间或在12至22个核苷酸残基之间。

10.权利要求1或权利要求3至9任一项所述的寡核苷酸或权利要求2 至9任一项所述的方法，其中，所述茎环结构的第一部分和第三部分各自包 含2至10个核苷酸或4至8个核苷酸。

11.权利要求1或权利要求3至10任一项所述的寡核苷酸或权利要求2 至10任一项所述的方法，其中，所述茎环结构的第二部分包含3至20个核 苷酸或4至6个核苷酸。

12.权利要求1或权利要求3至11任一项所述的寡核苷酸或权利要求2 至11任一项所述的方法，其中，所述寡核苷酸在3’末端用至少一种修饰进 行修饰，以阻止聚合酶产生的延伸和/或二聚体的形成。

13.权利要求1或权利要求3至12任一项所述的寡核苷酸或权利要求2 至12任一项所述的方法，其中，所述茎环结构阻止了(i)3’-5’核酸外切酶对所 述寡核苷酸的切割和/或(ii)聚合酶对所述寡核苷酸的延伸。