[发明专利]靶向整合

说明书

领域

本公开涉及编码重组蛋白的序列至感兴趣的细胞中的靶向整合。具体而言，感兴趣的 细胞包含位于预定的基因组位置之内或邻近预定的基因组位置的外源核酸序列，其中所述 外源核酸序列包含至少一个识别序列，所述识别序列可被一种或更多种多核苷酸修饰酶利 用，用于编码重组蛋白的序列的靶向整合。

背景

近年来，在哺乳动物细胞的基因组之内的限定位置的重组蛋白表达构建物的靶向整合 (TI)已在生物制药行业中激发了很多兴趣。TI技术允许细胞系开发科学家将感兴趣的转基 因整合到预先限定的、表征良好的基因组位置中，由此使得重组蛋白表达特征的预测成为 可能，其可引起增加的细胞系稳定性、降低的克隆至克隆和分子至分子异质性，并大体降低 的细胞系开发时间轴。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是用于生物治疗蛋白生产的最常用的细胞 系。但是，尽管它们在治疗性蛋白生产中的公认的有用性，但是迄今为止，CHO细胞中的TI获 得有限的成功。因此，需要在CHO和其它细胞中实施TI的改善的方法，所述方法将有益于生 物生产行业。

概述

在本公开的各种方面中，提供了分离的细胞，其包含位于基因组DNA中的至少一个外源 核酸序列，所述基因组DNA在表2中列举的至少一个基因组位置之内或邻近表2中列举的至 少一个基因组位置，其中各外源核酸序列包含用于多核苷酸修饰酶的至少一个识别序列。 在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在另一实施方式中，所述至少一个识别序列包含 不内源存在于所述细胞(或CHO细胞)的基因组中的核酸序列。在又一实施方式中，所述多核 苷酸修饰酶是靶向核酸内切酶(如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、类转录激活因子效应 物核酸酶(TALEN)、CRIPSR核酸内切酶、I-TevI核酸酶或相关的单体杂合物，或人工靶向DNA 双链断裂诱导剂)、位点特异性重组酶(如λ整合酶、Cre重组酶、FLP重组酶、γ-δ解离酶、Tn3 解离酶、ФC31整合酶、Bxb1-整合酶或R4整合酶)，或它们的组合。在又一实施方式中，第一 识别序列由第一ZFN对识别。在还一实施方式中，第一识别序列由第一ZFN对识别，且第二识 别序列由不同于第一ZFN对的第二ZFN对识别。在一次重复中，第一和第二ZFN对选自hSIRT、 hRSK4和hAAVS1。在还一实施方式中，外源核酸序列还包含至少一个选择性标记序列、至少 一个报道序列、至少一个调节控制序列元件或它们的组合。

本公开的另一方面包括用于制备包含至少一个外源核酸序列的细胞的方法，所述 外源核酸序列包含至少一个用于多核苷酸修饰酶的识别序列。所述方法包括(a)将至少一 种靶向核酸内切酶引入细胞中，所述靶向核酸内切酶被靶向至在表2中列举的基因组位置 之内或邻近在表2中列举的基因组位置的序列；(b)将至少一种包含所述外源核酸的供体多 核苷酸引入细胞中，所述外源核酸侧接(i)与靶向基因组位置具有实质的序列同一性的序 列或(ii)靶向核酸内切酶的识别序列；和(c)在使得外源核酸被整合到细胞的基因组中的 条件下维持所述细胞。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在另一实施方式中，通过同 源介导法将外源核酸整合到基因组中。在又一实施方式中，通过直接连接法将外源核酸整 合到基因组中。在还一实施方式中，靶向核酸内切酶选自锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、 类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRIPSR核酸内切酶、I-TevI核酸酶或相关的单体杂 合物，和人工靶向DNA双链断裂诱导剂。