[发明专利]靶向整合

权利要求书

1.分离的细胞，其包含至少一个位于基因组DNA中的外源核酸序列，所述基因组DNA在 表2中列举的至少一个基因组位置之内或邻近在表2中列举的至少一个基因组位置的，其中 各外源核酸序列包含至少一个用于多核苷酸修饰酶的识别序列。

2.权利要求1所述的分离的细胞，其中所述细胞是CHO细胞。

3.权利要求1或2所述的分离的细胞，其中所述至少一个识别序列包含不内源存在于所 述细胞的基因组中的核酸序列。

4.权利要求1所述的分离的细胞，其中所述多核苷酸修饰酶选自靶向核酸内切酶、位点 特异性重组酶和它们的组合。

5.权利要求4所述的分离的细胞，其中所述靶向核酸内切酶选自锌指核酸酶(ZFN)、大 范围核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRIPSR核酸内切酶、I-TevI核酸酶或 相关的单体杂合物，和人工靶向DNA双链断裂诱导剂。

6.权利要求4所述的分离的细胞，其中所述位点特异性重组酶选自λ整合酶、Cre重组 酶、FLP重组酶、γ-δ解离酶、Tn3解离酶、ФC31整合酶、Bxb1-整合酶和R4整合酶。

7.前述权利要求中任一项所述的分离的细胞，其中第一识别序列由第一ZFN对识别。

8.权利要求7所述的分离的细胞，其中第二识别序列由不同于所述第一ZFN对的第二 ZFN对识别。

9.权利要求7或8所述的分离的细胞，其中所述第一和所述第二ZFN对选自hSIRT、hRSK4 和hAAVS1。

10.前述权利要求中任一项所述的分离的细胞，其中所述外源核酸序列还包含至少一 个选择性标记序列、至少一个报道序列、至少一个调节控制序列元件或它们的组合。

11.用于制备包含至少一个外源核酸序列的细胞的方法，所述外源核酸序列包含至少 一个用于多核苷酸修饰酶的识别序列，所述方法包括

a)将至少一种靶向核酸内切酶引入细胞中，所述靶向核酸内切酶被靶向位于在表2中 列举的基因组位置之内或邻近在表2中列举的基因组位置的序列，

b)将包含所述外源核酸的至少一个供体多核苷酸引入所述细胞中，所述外源核酸侧接 (i)与所述靶向基因组位置具有实质的序列同一性的序列或(ii)所述靶向核酸内切酶的识 别序列；和

c)在使得所述外源核酸被整合到所述细胞的基因组中的条件下维持所述细胞。

12.权利要求11所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。

13.权利要求11或12所述的方法，其中通过同源介导法将所述外源核酸整合到所述基 因组中。

14.权利要求11或12所述的方法，其中通过直接连接法将所述外源核酸整合到所述基 因组中。

15.权利要求11-14中任一项所述的方法，其中所述靶向核酸内切酶选自锌指核酸酶 (ZFN)、大范围核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、CRIPSR核酸内切酶、I-TevI 核酸酶或相关的单体杂合物，和人工靶向DNA双链断裂诱导剂。

16.用于再靶向细胞以生产至少一种重组蛋白的方法，所述方法包括：

a)提供包含用于多核苷酸修饰酶的至少一个外源识别序列的细胞，所述外源识别序列 位于在表2中列举的至少一个基因组位置之内或邻近在表2中列举的至少一个基因组位置；

b)将(i)包含侧接第一和第二序列的编码重组蛋白的序列的至少一个表达构建物，和 (ii)识别所述细胞中的所述至少一个外源识别序列的至少一种多核苷酸修饰酶引入所述 细胞中；和

c)在使得编码所述重组蛋白的序列被整合到所述细胞的基因组中的条件下维持所述 细胞。

17.权利要求16所述的方法，其中所述细胞是CHO细胞。