[发明专利]利用核苷酸类似物和解旋酶恒温扩增DNA分子的方法

说明书

背景技术

(1)本发明所涉及的技术领域：

本发明的技术领域是核酸化学，具体地说是涉及扩增预选选定的DNA分子数量 (“扩增”目标DNA序列)的领域，更具体地说，本专利的技术领域覆盖恒温扩增流程和方法， 这里的恒温扩增流程不需要传统聚合酶链式反应中使用的温度循环。

(2)背景技术描述

在许多实际的应用方面，包括针对生物样品中DNA和RNA分子的诊断，“放大”特定 的核酸序列是最直接的一种方法。传统上，这项诊断工作是通过聚合酶链式反应(PCR)来完 成[R.K.Saiki,D.H.Gelfand,S.Stoffel,S.J.Scharf,R.Higuchi,G.T.Horn,K.B.Mullis, H.A.Erlich(1988)耐热性DNA聚合酶利用引物来扩增DNA分子。《科学》239,487-491]。在聚 合酶链式反应里，一个“正向引物”经过退火而结合到预先选择的目标寡核苷酸序列以形成 双链体。然后，DNA聚合酶将利用该引物和合适的2'-脱氧核苷三磷酸合成与目标寡核苷酸 序列互补的寡核苷酸产物(采用沃森-克里克互补规则)；目标寡核苷酸和合成的寡核苷酸 产物他们的序列互补，并且形成标准的DNA双螺旋结构。然后，双螺旋结构经过加热，通常在 温度超过75℃时“熔化”得到两个序列互补的单链DNA分子。在超过75℃以上的温度，每一条 单链DNA与其互补的DNA都是自由的。最初的目标分子，然后结合到第二个正向引物，同时产 物DNA分子结合到一个“反向引物”，这个反向引物被设计成能够结合到产物DNA分子下游的 一个特定的位点。然后，聚合酶继续利用引物进行复制和延伸，從而得到全长的双链DNA产 物(现在产物的数量翻倍)。接下來，通过加热两条DNA链再次分离，从而更多的正向和反向 引物经过退火与目标DNA分子结合。重复聚合酶链式反应，结果就可以产生大量目标DNA分 子以及其互补序列的拷贝。在不对称聚合酶链式反应(PCR)中，目标DNA分子和它的互补序 列的拷贝数目取决与正向和反向引物的比例。

经典的PCR被广泛应用于研究、科学和技术等领域，并且被作为首选的方法来检测 复杂生物样品中少量的DNA。然而，利用不同的温度循环以分离DNA双链体，在许多应用中有 它的局限性，例如，常规的PCR技术和仪器很难被用在医生办公室和随时随地的目标DNA分 子的即时检测。因此，大家希望不需要温度循环的扩增目标DNA分子的技术，这种恒温扩增 的需求在很多的文献中被提及，其中也包括被称为“重组酶聚合酶扩增”的文献(RPA) [Piepenburg,O.,Williams,C.H.,Stemple,D.L.,Armes,N.A.(2006)利用重组酶和聚合酶 扩增DNA。PLoSBiol4(7):e204],滚环法扩增(RCA)，NASBA，解旋酶协助的恒温扩增(HDA) [Tong,Y.,Lemieux,B.,；Kong,H.(2011)多种策略以改善灵敏度，速度和可靠的恒温核酸扩 增法快速病原体检测。BMCBiotechnol.11Art.No:50][Lemieux,B.,Li,Y.；Kong,H.M., Tang,Y.W.(2012)几乎不需要仪器的，简单和快速的检测单纯疱疹病毒的分子器件和方法： ExpertReviewMolec.Diagnostics12,437-443DOI:10.1586/ERM.12.34]和LAMP，等等。 这些均被称为“恒温扩增”的方法。

然而现在的恒温扩增方法常常表现欠佳。在许多情况下，扩增的效果似乎取决于 特定的目标分子的序列，或在扩增过程中使用的探针和所使用的引物的序列。在某些情况 下，恒温扩增会完全的失败。在许多情况下，除了目标分子的扩增产物以外，还会出现额外 的“伪”产品。当试图在一个试管中同时等温扩增多个寡核酸样品时(“多重恒温扩增”)，这 些伪产物更加容易产生。