[发明专利]利用核苷酸类似物和解旋酶恒温扩增DNA分子的方法

权利要求书

1.一种用于合成DNA分子的流程，该DNA分子互补于目标DNA分子，其中所述的目标DNA 分子杂交与互补的DNA分子成为双螺旋，本专利所述的方法包括将双螺旋DNA孵育在缓冲水 溶液中，缓冲液中有解旋酶，脱氧核糖核酸聚合酶，2'-脱氧核苷三磷酸，和含有非天然核苷 酸的引物，该引物的序列与目标DNA分子的一个序列片段基本上互补，并且在该引物中至少 一种腺嘌呤被2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代，或者引物中至少一个鸟嘌呤被肌苷取 代，或至少有一个胸腺嘧啶被2-硫代胸腺嘧啶取代，或者至少一个胞嘧啶被N4-乙烷基胞嘧 啶所取代，并且其中所述被替换的核苷酸的数目总数是2至6。

2.一种用于合成多个DNA分子的流程，这些DNA分子互补于目标DNA分子，其中所述的目 标DNA分子杂交与互补的DNA分子成为双螺旋，本专利所述的方法包括将双螺旋DNA孵育在 缓冲水溶液中，缓冲液中有解旋酶，脱氧核糖核酸聚合酶，2'-脱氧核苷三磷酸，和两种含有 非天然核苷酸的引物，一种是正向引物和另一种是反向引物，所述正向引物的序列基本上 互补与目标DNA分子的一个片段，所述的反向引物的序列基本与目标DNA分子下游某段序列 相同，并且在每一种引物中至少一种腺嘌呤被2-氨基嘌呤或2，6-二氨基嘌呤替代，或者每 一种引物中至少一个鸟嘌呤被肌苷取代，或至少有一个胸腺嘧啶被2-硫代胸腺嘧啶取代， 或者至少一个胞嘧啶被N4-乙烷基胞嘧啶所取代，并且每一种引物中被替换的核苷酸的总 数目是2至6。

3.根据权利要求1所述的流程，包括在一个或多个被取代引物的5'-末端附加一个预先 选择的寡核苷酸标记，该寡核苷酸标记至少包含下图中的一个核苷碱基

其中X选自于包含N和CH的基团，W为硝基，氰基，或另外一种吸电子基团，R是连接所指 示的杂环碱基到寡核苷酸的地方。

4.根据权利要求2所述的流程，包括在一个或多个被取代引物的5'-末端附加一个预先 选择的寡核苷酸标记，该寡核苷酸标记至少包含下图中的一个核苷碱基

其中X选自于包含N和CH的基团，W为硝基，氰基，或另外一种吸电子基团，R是连接所指 示的杂环碱基到寡核苷酸的地方。

5.根据权利要求1所述的流程，被取代的核苷酸是放置在距离引物3'-末端第二到第八 核苷酸的位置。

6.根据权利要求2所述的流程，被取代的核苷酸是放置在距离引物3'-末端第二到第八 核苷酸的位置。

7.根据权利要求1所述的流程，被取代核苷酸的总数目是4，并且这些取代核苷酸被放 置在所述引物的3'-末端第二到第五核苷酸的位置。

8.根据权利要求2所述的流程，被取代核苷酸的总数目是4，并且这些取代核苷酸被放 置在所述引物的3'-末端第二到第五核苷酸的位置。