[发明专利]制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法及其应用

说明书

本发明涉及通过在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、并从所述肉毒杆菌毒素分离神经毒性组分来制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法。另外，本发明涉及可通过本发明的方法获得的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分及其应用。

技术领域

本发明涉及通过在允许产生肉毒杆菌毒素的条件下培养肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)、并从所述肉毒杆菌毒素分离神经毒性组分来制备高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分的方法。另外，本发明涉及可通过本发明的方法获得的高纯度的肉毒杆菌毒素神经毒性组分及其应用。

背景技术

肉毒杆菌毒素是针对人类的最强有力的蛋白质毒素。它们通过阻断神经肌肉接头处的乙酰胆碱释放起作用，导致肌肉去神经支配。肉毒杆菌毒素在其他周围性胆碱能神经末梢处也具有活性并引起，例如，减少唾液分泌或出汗以及减轻面部的纹路和皱纹。由于它们作用方式的特殊性，肉毒杆菌毒素的临床应用范围在持续增长，并且肉毒杆菌毒素如今被广泛用作药学美容品。

肉毒杆菌毒素由特定梭菌菌属合成和释放，其形式为包含肉毒杆菌毒素分子(“神经毒性组分”)和相关的非毒性细菌蛋白质(也称为“复合蛋白质”)的大复合体。所述复合蛋白质包括不同的非毒性血凝素(HA)蛋白质和非毒性的非血凝素(NTNH)蛋白质。所述毒素复合体的分子量在七种不同的肉毒杆菌毒素血清型(A，B，C，D，E，F和G)之中为从约300kDa至约900kDa不等。所述复合蛋白质给所述神经毒性组分提供了稳定性。与所述毒素复合体不同，所述神经毒性组分在它的分离和纯粹形式、即没有任何复合梭状芽胞杆菌蛋白质下，是酸不稳定性的并且不耐受胃肠道中的侵蚀性环境。

对于全部七种已知的肉毒杆菌毒素血清型来说，所述神经毒性组分是以分子量约150kDa的无活性单链前体(未裂解的多肽)合成的。这种单链前体通过蛋白质水解性裂解被活化，产生二硫键连接的双链蛋白质。50kDa的轻链含有催化结构域，而100kDa的重链含有内部易位结构域和受体结合结构域。所述100kDa的重链介导了与突触前胆碱能神经末梢的结合和毒素进入细胞的内化。所述50kDa的轻链负责毒性效应，充当锌-内肽酶和裂解负责膜融合的特殊蛋白质(SNARE复合体的蛋白质)。通过破坏神经细胞内的膜融合过程，肉毒杆菌毒素阻止乙酰胆碱释放到突触间隙中。

1989年，A血清型肉毒杆菌毒素复合体(BoNT/A-复合体)在美国首次被批准为人类所用，用于治疗斜视、眼睑痉挛和其他失调。如今，“A”形式的肉毒杆菌毒素复合体可从若干来源商购，例如以商品名得自Allergan、以商品名得自Ipsen、和以商品名得自Galderma。

然而，在相当一部分情况下，患者响应反复的BoNT/A-复合体注射产生中和抗体。据认为，这种效应与BoNT/A-复合体的复合蛋白质有关。受到影响的患者变成所谓的“继发性非应答者(secondary non-responders)”，并且用BoNT/A-复合体治疗不再有效。发现这种抗体引起的治疗失败的风险影响了不少于10％至20％的治疗对象。与使用肉毒杆菌毒素复合体有关的另一个缺点是它在注射到靶肌肉中之后的区域性或全身性扩散。例如，利用单纤维肌电图(SF-EMG)的研究显示在远离注射部位的肌肉中抖动增加。

在施用纯神经毒性组分时，观察不到这些缺点。特别是，施用纯神经毒性组分降低了不响应或响应降低的风险，这对于进行长期治疗的患者特别重要。与纯神经毒性组分有关的其他利益包括快速发病效应和优良的温度稳定性，所述温度稳定性甚至消除了对冷藏链和在冰箱中储存的需要。只含有A型神经毒性组分而没有任何复合蛋白质的制剂可从Merz以商品名和商购。