[发明专利]诊断结核病的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种诊断结核病的方法。具体地，本发明涉及活动性结核病 (activetuberculosis(TB))的血清学诊断方法，该血清学诊断方法基于检测 哺乳动物受试者中针对源于结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的脂质 抗原的抗体。

背景技术

对于诸如TB的疾病，尽管已有报道在针对患有TB的患者血清中结核分 枝杆菌的各种抗原的抗体的研究上取得了极大的进展，但迄今一直没有能足 够有效地保证TB诊断结果的商业化血清学TB诊断测试(Weyer等人，2011 年)。

本发明提供一种通过检测含有免疫球蛋白的体液样品中的替代标记物抗 体诊断结核病的方法。替代标记物是疾病的指标，由宿主对感染的响应产生， 而不是由感染因子自身产生。

所述替代标记物抗体是特异性地识别源自结核分枝杆菌的分枝菌酸抗原 的抗体(Verschoor等人，1998年，US7,122,577)，且本申请人认识到，这 样的抗体的流行率不会因HIV协同感染而受影响，HIV是引起AIDS的病毒 (Schleicher等人，2002年)。本申请人还认识到，可通过竞争性结合抑制 免疫测定的手段检测抗体，以便将该抗体与普遍存在的交叉反应抗胆固醇抗 体区别(Verschoor等人，2005年，Thanyani等人，2008年，Benadie等人， 2008年)。本申请人进一步认识到，可使用稀释的样品利用生物传感技术实 时检测抗体与固定在传感器表面上的含分枝菌酸抗原的脂质体的结合，以提 高检测的灵敏度和特异性相比于标准免疫测试如ELISA(Verschoor等人， 2005，Thanyani等人，2008年，Lemmer等人，2009年)。本申请人进一步 认识到，使用电化学阻抗谱(EIS)技术，可以在具有嵌入分枝菌酸抗原的自 组装脂质单层上对替代标记物抗体进行终点检测(Mathebula等人，2009年， Ozoemena等人，2010年)。

在所引用的现有技术中，已经给予适用于结核病的诊断的技术缩写 “MARTI”，即分枝菌酸抗体实时抑制测试(Lemmer等人，2009年)。然 而，由于所述MARTI-测试需要昂贵且费力的生物传感器技术，如表面等离 子体共振(surfaceplasmonresonance)、伴随低样品通量以及高维护要求， 其应用是具有挑战性的。Mathebula等人(2009年)和Ozoemena等人(2010 年)的电阻抗谱技术试图找到一种所述替代标记物抗体的生物传感器检测方 法，以更适合于实际诊断应用。尽管技术上成功，但其偏离了将MARTI作 为终点抗体结合检测测试予以实施的原理，当使用较多的血清样品组进行验 证时，会预期到不足的灵敏度。

本发明通过以新颖的方式配置电阻抗的测定，将电阻抗生物传感器途径 应用于MARTI-测试的原理，对现有技术提供了改进。这需要排除抗体-抗原 在电极传感器表面暴露后的洗涤步骤，并包含与含抗体的样品结合的氧化还 原探针或类似的导电物质。这种设置通过防止低亲和力的生物标志物抗体连 同未结合的血清成分的洗除提高了测试的灵敏度。本发明利用价格低廉、耐 化学溶剂、丝网印刷型、一次性的电极使MARTI-测试的原理适用于高样品 通量。另外，本发明为抑制的样品和非抑制的样品提供了连续注射，即将所 述抑制的样品和非抑制的样品依次暴露于相同的传感器表面，这使得每个样 品仅需要一个一次性的电极即可进行全面分析。

以前已经探索了用于TB的检测的各种方法。基于压电的生物传感器(He 等人，2002年，Ren等人，2008年)、基于DNA结合的生物传感器(Das 等人，2010年)、基于磁弹性的生物传感器(Pang等人，2008年)，基于 声波的生物传感器(He等人，2003年)，以及基于SPR的DNA传感器(Duman 和Erhan，2010)。然而，这些创新旨在直接的杆菌检测，并未涉及低亲和 力的抗体的洗除。Pang等人(2008年)的方法中使用痰样品，并已知为适合 HIV协同感染的患者。用于TB检测的生物传感器具有巨大的科学和商业利 益，但对肺外、儿科和HIV协同感染的群体中还没有提供解决方案。