[发明专利]用于改善的病毒生产的禽类细胞

说明书

发明领域

本发明涉及一种禽类细胞，其中至少一种干扰素诱导型跨膜蛋白(IFITM)的表达和/或活性减少。

发明背景

对病毒性感染和疾病的预防和控制代表了对于医学和兽医学的一项持续挑战。因此，减少病毒性疾病的发病率和严重性的方法保持在医学和生物学技术研究的前沿。

目前用于控制病毒性感染和疾病的最常见的策略是疫苗接种的方法。疫苗可以包含灭活的病毒或其纯化的产物，其已经使用化学物例如氮杂环丙烷(aziridine)处理，例如二乙烯亚胺(binaryethyleneimine,BEI)。或者，疫苗可以包含活的、减毒的病毒，其已经在导致毒力丧失而保持免疫原性的条件下培养。例如，致病性病毒可以通过一系列细胞培养物或动物胚胎传代，直到它在其靶细胞中在复制方面足够差，使得其可以用作疫苗的点。在这点时，病毒已经丧失了毒力但仍然具有免疫原性并能够刺激免疫反应。

胚胎鸡蛋和原代鸡胚胎成纤维细胞(CEF)通常用于制造人用和兽用病毒疫苗，包括传统的大体积疫苗例如流感或新城疫(NewcastleDisease)疫苗以及更现代的用于疫苗的重组病毒载体(例如痘病毒)。为了生成无毒力的减毒病毒，胚胎鸡蛋和CEF用于传代病毒。利用减毒病毒的疫苗的例子包括麻疹疫苗，腮腺炎疫苗，风疹疫苗，口服脊髓灰质炎疫苗(Sabin)和黄热病疫苗。

病毒性疾病对动物和人类健康两者的全球负担导致要求大规模生产疫苗中使用的灭活的和减毒的病毒。另外，季节性流行病的爆发，例如流感的爆发，要求在短时期内生产大量的病毒。实际上，流行病期间治疗有效的流感病毒疫苗的全球可用性仍然是对于生物医药工业的重大挑战。

影响胚胎鸡蛋和CEF在生产用于疫苗的病毒中的使用的一个当前问题是生成所需的大量病毒所花费的时间。另外，在疫苗中使用活的，减毒的病毒的一个缺点是为了生成减毒的病毒，在宿主细胞中达到足够数量的传代所花费的时间长度。例如，高度减毒的修饰疫苗病毒Ankara(MVA)，其充当候选疫苗以针对感染性疾病和癌症免疫，要求在CEF中多于500次传代以生成减毒的MVA，其丧失了编码基因组序列的重要部分，并对哺乳动物细胞表现出对复制的严重限制。另外，对宿主细胞中病毒传代速率的限制可能作为限制步骤，从而影响病毒生产和产出(yield)。

因此，需要在用于生产疫苗的系统(例如胚胎鸡蛋和CEF中)中增加灭活的和减毒的病毒两者的产出和生产效率的方法。

附图简述

图1：chIFITM基因座结构和多序列比对

Gga5上的IFITM基因簇侧翼有ATHL1和BAGALNT4。这一区域与Hs11上的IFITM基因簇同线(syntenic)(A)。使用ClustalW和手动比对细化(manualalignmentrefinement)进行了人，黑猩猩和鸡直系同系物(ortholgoue)比对，并使用BioEdit注释。彩色柱示出了所有的9种IFITM序列之间共享的残基。使用序列下方的符号突出显示了重要的残基：Δ-酪氨酸；O-双半胱氨酸；*-对于多聚化重要的苯丙氨酸；↑-保守的泛素化赖氨酸。IM1(膜内1)，CIL(保守的胞内环)，IM2(膜内2)。

图2：使用一系列假型化(pseudotyped)病毒感染A549细胞，所述假型病毒具有狂犬病病毒糖蛋白包膜(CVS；攻击病毒标准品(狂犬病病毒)，MHK；莫科拉(Mokola)病毒和RV1，拉哥斯蝙蝠(Lagosbat)病毒)或流感血凝素包膜(H1(人)，H4(禽)和H5(人)，H7(禽)，H10(禽))。

图3：过表达的IFITM蛋白在A549细胞中的细胞定位。

图4：(A)IFN-γ刺激后，DF-1鸡细胞中chIFITM3表达的对数倍数变化(logfoldchange)，(B)使用chIFITM3特异性siRNA(CH)或杂乱(scrambled)siRNA(NS)的chIFITM3敲低百分比，(C)使用甲型流感病毒(A/WSN/1933(WSN/33))对DF-1细胞的感染，使用针对核蛋白(NP)的抗体通过流式细胞术测量。在所有情况下，使用与chIFITM特异性siRNA(CH)或杂乱siRNA(NS)的预孵育。误差棒表示以一式三份进行的每种条件间的标准偏差。

图5：鸡IFITM转录物在一组组织中的差异表达。

图6：根据表达的蛋白水平(A)，根据HA标签的蛋白印迹(B)表达不同水平chIFTIM3蛋白的A549细胞限制用拉哥斯蝙蝠病毒(LBV)糖蛋白包膜假型化的慢病毒的复制。