[发明专利]利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一物种鉴定方法，更具体而言是根据核酸裂解后片段的分子量大小，来进行物种鉴定的方法。

背景技术

生物物种或同种异型的辨识大部分都是以DNA序列定序的方法进行，此方法在临床应用时会遇到过程繁杂，效率低及费用高的问题。另一种方法是使用限制性片段长度多态性(RFLP)，然而此方法的精确性却不够高，因为在胶体电泳时，相近长度的核酸裂解片段将无法轻易的被分辨出来，或是相同长度但不同序列的核酸裂解片段也无法由胶体电泳而分辨出来。虽然后续有很多其他的方法被开发，例如：DNA microarray，Real time PCR，次世代DNA定序技术等，但是都存在技术不稳定导致结果的不确定(如：DNA microarray，Real time PCR)及高费用(如：次世代DNA定序)。以人类乳突病毒DNA microarray分型方法为例，DNA探针设计时由于DNA序列的相似度较高区域导致杂交反应使得非专一性增加而误判；另外，当初产品设计时之检测类型的拘限，病毒发展之高变异性使得原方法无法定型等已成为目前急需解决的问题。

发明内容

本发明之目的，在于提供一种物种分型鉴定的方法，其利用核酸裂解后的片段分子量，而非利用胶体电泳或探针杂合反应，因此本方法稳定性及准确度高，不会因非专一性的杂合而发生误判，在辨识核酸裂解片段时，精准度非常高，一碱基的些微大小差距都能被备侦测，由于不同分子的分子量皆不同，因此同样核酸裂解片段长度，但是不同的序列，皆能被本发明所提供的方法所所侦测。此外在本发明的方法操作步骤简便，费用低廉且具有高效率。

为达上述目的并解决习知技术之缺点，本发明提供一种物种分型鉴定的方法，包括以下步骤：

(S10)进行一聚合酶连锁反应，通过至少一对特定引子，扩增一被检测物种的一段核酸序列；

(S20)进行一核酸酶裂解反应，通过至少一个核酸酶，将所述被检测物种的所述核酸序列裂解，而产生数段分子量大小不同的被检测核酸裂解片段；

(S30)以一质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小；

(S40)将所述被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与一资料库中预存的一已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较；

(S50)当所述被检测核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两者的分子量之间相差小于一特定道尔吞值时，则认定两者为相同的核酸裂解片段；以及

(S60)计算所述认定为相同的被检测核酸裂解片段的数量N相对于所述已知物种的已知核酸裂解片段的总数M的一比值N/M，并以所述比值N/M代表所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相似度。

根据本发明的一个实施例的进一步特征，所述特定道尔吞值为2道尔吞。

根据本发明的一个实施例的进一步特征，当所述步骤(S40)中的资料库中的已知物种为2个或以上时，在步骤(S60)后进一步包含以下步骤：

(S71)从所述资料库中多个物种的多个所述比值N/M中，随机取一较大的比值，做为一高相似度丛集的中心，随机取一较小的比值，做为一低相似度丛集的中心；

(S72)计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；

(S73)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述低相似度丛集；

(S74)计算出所述高相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的高相似度丛集的中心，计算出所述低相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；

(S75)再次计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；

(S76)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述低相似度丛集；及

(S77)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种；