[发明专利]利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法

权利要求书

1.一种利用核酸裂解片段的分子量进行物种分型鉴定的方法，其特征在于：

所述方法包含步骤:

(S10)进行一聚合酶连锁反应，通过至少一对特定引子，扩增一被检测物种的一段核酸序列；

(S20)进行一核酸酶裂解反应，通过至少一个核酸酶，将所述被检测物种的所述核酸序列裂解，而产生数段分子量大小不同的被检测核酸裂解片段；

(S30)以一质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小；

(S40)将所述被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与一资料库中预存的一已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较；

(S50)当所述被检测核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两者的分子量之间相差小于2道尔吞值时，则认定两者为相同的核酸裂解片段；以及

(S60)计算所述认定为相同的被检测核酸裂解片段的数量N相对于所述已知物种的已知核酸裂解片段的总数M的一比值N/M，并以所述比值N/M代表所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相似度，

其中当所述步骤(S40)中的资料库中的已知物种为2个或以上时，在步骤(S60)后进一步包含以下步骤：

(S71)从所述资料库中多个物种的多个所述比值N/M中，随机取其中一较大的比值，做为一高相似度丛集的中心，并随机取其中一较小的比值，做为一低相似度丛集的中心；

(S72)计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；

(S73)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种被分配到所述低相似度丛集；

(S74)计算出所述高相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的高相似度丛集的中心，计算出所述低相似度丛集中所有物种的所述比值N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；

(S75)再次计算所述所有物种的所述比值N/M与所述高相似度丛集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值；

(S76)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述高相似度丛集；相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述低相似度丛集；及

(S77)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种；

其中当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种与之前不相同，则重复步骤(S74)、步骤(S75)及步骤(S76)直到被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：在所述步骤(S40)前，先将资料库中预存的所述已知物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库中预存的另一已知相近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较，以确定两者之间具有那些重复的已知核酸裂解片段；接着在进行步骤(S40)时，使所述被检测物种的各被检测核酸裂解片段省略执行与所述重复的已知核酸裂解片段的比较作业。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：将资料库中预存的所述已知物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库中预存的所述另一已知相近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较时，所述已知物种及所述另一所述已知物种皆选自于所述高相似度丛集中的物种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核酸序列为DNA序列。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：在所述步骤(S20)之前，先进行一转录反应，将DNA序列转录为RNA序列。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述核酸酶为RNase。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述RNase为RNase A，其针对所述RNA序列中的U位进行点裂解。