[发明专利]采用非干扰性蛋白质染剂的HCP抗血清验证

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年11月12日提交的61/903,234号美国临时专利申请的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。

背景技术

生物物质药物或生物物质，例如治疗性蛋白质，一般源自宿主细胞。例如，可以通过遗传学方式工程改造宿主细胞，以生成治疗性重组蛋白。又如，所述生物物质可以是内源性非重组蛋白。所述宿主细胞可经收获并裂解，然后可通过多种方法从污染性宿主细胞组分纯化所述生物物质。或者，该生物物质可由宿主细胞分泌进入条件培养基，收取该培养基，并从条件培养基中的污染物质纯化所述生物物质。宿主细胞污染物包括宿主细胞蛋白(HCP)。

HCP污染物可能会具有不希望的作用，即便在极低的浓度下也是如此。例如，它们会干扰所述生物物质的功能。又如，HCP污染物会诱导免疫系统对该生物物质的过敏反应或排斥。因此，相信将全部、基本全部或大部分HCP污染移除，能够减少不希望的作用。

因此，生物物质的质量控制测试通常包括：用以显示HCP污染物已被充分移除的测试，足以使HCP污染处于较低、允许的水平。低水平污染物的检测可采用免疫化学试验来进行，其一般具有低检测限制。例如，ELISA可联合多克隆抗体混合物使用，该抗体混合物开发成对多种可能HCP具有反应性。多克隆抗体混合物的开发需要对识别的可能靶标的数量，以及所述试验的灵敏度和特异度进行优化。因此，在采用多克隆抗体混合物之前，需要通过证明其能以可接受的灵敏度和特异度检测足够数量的HCP来对其进行验证。

HCP试验验证可通过二维(2-D)电泳和western印迹来进行。例如，两等份的样品可在两个不同的2-D电泳凝胶上通过尺寸和等电点各自分离。一个凝胶可用高灵敏总蛋白质染剂(例如银、锌、铜或考马斯G-250染剂)染色，并观察染色斑点的数量，以确定样品中总蛋白的大致数量。第二个凝胶可转移至western印迹膜，并用候选多克隆抗体混合物探测。总蛋白质染剂和western印迹所检测蛋白质之间的比较能够确定该抗体混合物的特异度和灵敏度。

因此，该技术需要能够以合理的信心确认凝胶图像和印迹图像之间鉴定的特征/斑点是否对应相同的蛋白质。具体而言，当凝胶和印迹图像中的相同对应位置上存在某一特征时，拟为匹配。然而，当所述多个图像或图像内多个个体特征彼此不配准时，对于匹配的指定会变得复杂。如下原因可能造成凝胶图像和印迹图像或其中的特征之间缺乏配准：电泳、转移和染色中的不一致，并且，所述图像可能因为凝胶的收缩和膨胀而具有不同尺寸。这些不一致的原因等等会造成不正确或模糊的匹配。

发明内容

本发明提供一种验证多克隆抗体混合物的改进的方法，所述多克隆抗体混合物用于检测生物样品中的污染性宿主细胞蛋白(HCP)。在一些实施方式中，所述方法对于总蛋白质染色和western印迹检测无需分别的2-D凝胶。

在一些实施方式中，本发明提供用于验证包含多克隆抗体混合物的免疫学检测试剂的方法，所述多克隆抗体混合物用于检测生物样品中的污染性宿主细胞蛋白(HCP)，所述方法包括：提供包含HCP的生物样品；通过表观分子量和等电点来分离HCP；将分离的HCP转移至膜，由此产生结合至膜的HCP；采用非干扰性总蛋白质染剂对结合至膜的HCP染色，由此用所述非干扰性总蛋白质染剂检测所述膜上的宿主细胞蛋白(HCP)位置；观察并记录非干扰性总蛋白质染剂测得的该膜上的HCP位置；使该膜与所述多克隆抗体混合物接触，由此使来自多克隆抗体混合物的抗体与结合至膜的HCP相结合；检测与该膜结合的来自所述多克隆抗体混合物的抗体，由此采用所述多克隆抗体混合物检测该膜上的HCP位置；观察并记录所述多克隆抗体混合物测得的该膜上的HCP位置；和，比较非干扰性总蛋白质染剂测得的HCP位置和所述多克隆抗体混合物测得的位置，由此验证用于检测生物样品中污染性宿主细胞蛋白HCP的多克隆抗体混合物。

在一些方面中，在使所述膜与多克隆抗体混合物接触之前，所述非干扰性总蛋白质染剂从所述膜基本移除。例如，可通过将膜接触封闭溶液来使所述非干扰性总蛋白质染剂从所述膜基本移除。在一些情况中，所述封闭溶液包含血清白蛋白、明胶或酪蛋白的缓冲溶液；血清或脱脂奶；或含有亲水性或两亲性合成聚合物的无蛋白封闭溶液。