[发明专利]不具有信号肽的天然分泌多肽的表达

说明书

对序列表的引用

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发明领域

本发明涉及重组生产天然分泌多肽的多种方法，这些方法包括以下步骤：提供一种微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸；在有益于该多肽表达的条件下培养该微生物宿主细胞，并且可任选地，回收该多肽，连同微生物、某些多核苷酸、表达构建体和蛋白酶取代变体。

发明背景

一种被表示为PfuS的热稳定的分泌蛋白酶分离自强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)，并且先前已经使用包括分泌信号的表达DNA构建体生产，但PfuS蛋白酶的产率是相当低的(EP0994191A1；宝生物公司(Takara)，日本)。感兴趣的是为了可在工业上采用该酶，增加来自强烈火球菌的热稳定的PfuS蛋白酶的表达产率，使得它可以足够的量和可接受的生产经济产生。

从嗜热网团菌(Dictyoglomusthermophilum)中鉴定并克隆了一种被表示为XynB的热稳定的分泌木聚糖酶，使该酶重组表达于大肠杆菌中。XynB的成熟N末端定位在23-氨基酸前导肽的下游，如由SignalP信号肽分析软件预测的，并且受以其他细菌家族11种木聚糖酶执行的多序列分析结果的支持。该XynB前导肽使得该酶对大肠杆菌具有毒性。该XynB酶表达于大肠杆菌中(不具有前导肽)，并且通过细胞裂解回收(莫里斯(Morris)DD等人1998，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64(5):1759-65)。该XynB酶还重组表达于枯草芽孢杆菌宿主中，具有其天然分泌信号，但仅以非常低的产率(张(Zhang)等人；应用生物化学与生物技术(ApplBiochemBiotechnol)(2010)160:1484-1495)。感兴趣的是为了可在工业上采用该酶，增加来自嗜热网团菌的热稳定的XynB木聚糖酶的表达产率，使得它可以足够的量和可接受的生产经济产生。

芽孢杆菌属宿主细胞已经被表征为工业制造各种感兴趣多肽的主力，主要是因为它们主动分泌具有所谓信号肽的多肽。信号肽是一种小多肽，典型的是约20-30个氨基酸，该小多肽以与待分泌多肽的N-末端的转录和翻译融合体表达。它指导该融合的多肽进入适当配备的宿主细胞的分泌机构中，于是该融合的多肽裂解，这时不具有其信号肽的现已成熟的感兴趣多肽被分泌进入周围培养液中，该信号肽保留在细胞中并且被降解。

芽孢杆菌属中重组生产的感兴趣多肽的分泌能够使得不用必须进行细胞裂解步骤而直接从培养液中比较容易地回收多肽。在芽孢杆菌属中，只有肯定会从细胞输出至生长培养基中的多肽是天然具有信号肽的。

细胞中大多数的多肽不是肯定会输出的，而是相反原本在细胞内、周质、膜结合的等等。此类天然非分泌多肽通常被认为是难以产生的，因为它们需要从宿主细胞内回收，这通常需要麻烦的细胞裂解步骤，导致回收过程具有挑战性，这进而是天然分泌酶对于工业制造是优选的原因。

发明概述

为了研究该PfuS蛋白酶和该XynB木聚糖酶(无天然C-末端纤维素结合结构域)在芽孢杆菌属中的表达水平，这两种酶被表达为具有众所周知的有效的芽抱杆菌属信号肽的翻译N-末端融合多肽。然而，无论用什么实验方法这些酶在芽孢杆菌属宿主中还是在没有任何信号肽的情况下表达。

与预期相反，当这些酶在没有任何分泌信号肽的情况下表达时，我们发现这两种酶在上清液中的产率比较高，如在此的实例中证明的。这是一个高度令人惊讶的结果并且具有经济意义，因为它证明PfuS样蛋白酶和XynB样木聚糖酶可以在芽孢杆菌属中产生(不具有信号肽)，并且相比于采用了信号肽的情况具有更高的产率。这些酶可以成功地从培养液中直接回收而不需要昂贵的细胞裂解步骤。

因此，在第一方面，本发明涉及重组生产天然分泌多肽的多种方法，这些方法包括以下步骤：

a)提供一种微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸；

b)在有益于该多肽表达的条件下培养该微生物宿主细胞，并且可任选地，

回收该多肽。

在第二方面，本发明涉及一种重组微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸。