[发明专利]细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶以及使用其的多糖的制造方法

说明书

本发明提供一种具有细菌肝素前体‑葡萄糖醛酸‑5‑差向异构酶活性的多肽，以及提供一种制造己糖醛酸残基被异构化的多糖的方法。筛选非洲大蜗牛cDNA文库，得到对作用于N‑乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基和/或完全脱硫酸化·N‑乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基的异构酶即细菌肝素前体‑葡萄糖醛酸‑5‑差向异构酶的多肽进行编码的DNA。在昆虫细胞中表达被该DNA编码的多肽，得到具有细菌肝素前体‑葡萄糖醛酸‑5‑差向异构酶活性的多肽。通过使该多肽与N‑乙酰基细菌肝素前体、或完全脱硫酸化·N‑乙酰化肝素接触，从而得到己糖醛酸残基被异构化的多糖。

技术领域

本发明涉及一种细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶(heparosan-glucuronic acid-5-epimerase)。具体而言，本发明涉及一种具有将N-乙酰基细菌肝素前体的葡萄糖醛酸残基异构化为艾杜糖醛酸残基的活性和/或将完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素的艾杜糖醛酸残基异构化为葡萄糖醛酸残基的活性的源自非洲大蜗牛的酶；具有该活性的多肽；编码该多肽的核酸、含有该核酸的载体、保持该核酸和/或该载体的宿主细胞、该多肽的制造方法、使用该酶和/或该多肽的己糖醛酸残基被异构化的多糖的制造方法等。

背景技术

本申请的说明书中有使用以下简写符号的情况。

GAG：糖胺聚糖

PG：蛋白多糖

GlcNAc：N-葡糖胺乙酰萄糖胺

GlcNS：N-硫酸化葡糖胺

GlcN：葡糖胺

GlcA：葡萄糖醛酸

IdoA：艾杜糖醛酸

IdoA(2S)：2-O-硫酸化艾杜糖醛酸

HexA：己糖醛酸

aMan：2,5-脱水甘露糖

AS：acharan硫酸(acharan sulfate)

ACH：acharan(2-O-脱硫酸化AS)

NAH：N-乙酰基细菌肝素前体

NSH：N-脱乙酰化·N-硫酸化细菌肝素前体

HEP：肝素

CDSNAc-HEP：完全脱硫酸化·N-乙酰化肝素

CDSNS-HEP：完全脱硫酸化·N-再硫酸化肝素

HS：硫酸乙酰肝素

C5-epi：细菌肝素前体-N-硫酸-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶

HG-5epi：细菌肝素前体-葡萄糖醛酸-5-差向异构酶

已知Acharan Sulfate(AS)是从非洲大蜗牛(Achatina fulica)分离出来的糖胺聚糖(GAG)的一种，为包含下述结构式(1)所示的由GlcNAc和IdoA(2S)构成的二糖(-[4GlcNAcα1-4IdoA(2S)α1]-)进行重复聚合的结构的直链状的GAG(非专利文献1、2)。另外，已知AS具有与作为糖链骨架共同的GAG的肝素(HEP)或硫酸乙酰肝素(HS)相似的生理活性，具体地显示出血管新生抑制活性(非专利文献3)、免疫刺激活性(非专利文献4)、降低血糖活性(非专利文献4)、抗凝血活性(非专利文献5)、抗肿瘤活性(非专利文献6)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的粘附抑制活性(非专利文献7)等。