[发明专利]活细胞的冷冻保存

说明书

技术领域

本发明涉及冷冻保存(低温保存(冷冻保存，cryopreservation))细胞，特别是包括藻类的植物细胞、(植物)细胞器以及(植物)组织的领域。

背景技术

植物细胞和组织培养是在基础和应用研究中广泛使用的重要工具。它们允许高通量研究，如基因功能和调节、代谢分析或生物农药(生物杀虫剂)开发。它们还是引人注目且功能强大的在生物反应器中产生精细化学品的生物机制。尤其是，植物细胞培养在产生适当糖基化和折叠的药物活性蛋白(如免疫球蛋白、白细胞介素)方面令人感兴趣。它们本质上安全，这与哺乳动物或微生物生产平台相反，因为它们不是宿主人病原体，也不产生内毒素。然而，在涉及植物生物学的各实验室中维持多种野生型和转基因细胞系不仅费力费钱，而且还会产生微生物污染、不期望的遗传改变(例如，染色体变化，包括倍性变化、表观遗传不稳定性(epigeneticinstability))以及最终培养物损失的风险。

实际上，大多数的动物和陆生植物使用不同的机制以增强它们在极端环境条件下的存活。例如，为了适应其生长和发育，植物可以感觉小温度变化(1℃)。此外，生长在温带(temperate)和冷气候区中的大多数植物在其生命周期期间倾向于严寒(冰冻，freezing)温度。在这些环境条件下，导致细胞死亡的主要原因与细胞脱水和由胞外冰形成引发的机械应力连同包围细胞器或细胞本身的生物膜严重损伤有关。因此，植物已经发展出复杂的策略来预防在温和冷冻条件下的细胞损伤。为了存活，植物通常需要预暴露于非致命温度，即，冷适应步骤。该过程涉及多种机制，包括累积冷冻保护代谢物和抗冻蛋白。由于极端温度代表着对于植物的重大压力，耐冻性仍然为限制全球植物分布的关键因素。

50多年来，在材料内整合活细胞已被识别为生物技术中强有力的工具。通过粘附在基质(substrate)上的固定、在材料中的捕获或包封是可以在新设备如生物反应器、生物传感器、生物燃料细胞和人工器官的结构中操控全细胞利益的方法。实际上，从其天然环境分离的细胞通常是脆弱的。基于细胞的生物技术装置因此需要将细胞整合入非生物材料(abioticmaterials)。

保存植物材料的常用策略涉及建立在生长条件下的植物组织或在田间的植物群体的体外收集。对于长期储存，因为保存植物组织的成本和质量问题，这些方法是不合适的。现在，大多数植物在没有高浓度冷冻保护剂(防冻剂)(其可以是细胞毒性的)或脱水工序下不能存活于冻融循环。而且，这些方法的成功与复杂的冷却程序是紧密关联的。例如，以最佳速率将细胞冷却到中间温度(略低于凝固点)，然后在液氮中玻璃化。事实上，这些措施允许在细胞内空间使细胞脱水和冰结晶最小化，其负责不可逆的细胞损伤。最后，由此获得的生物材料存储在昂贵的填充液氮的罐中，以使温度维持在-196℃。在这些条件下，几乎所有的代谢活动都停止，而活组织可以保存延长的时间。

目前，已经提出了三种不同的方法用于低温保存在液氮中的植物细胞培养物：

(A)慢冷却技术

(B)玻璃化(vitrification)方法，以及

(C)在藻酸盐珠粒内脱水固定化的细胞

描述了各种固定或包封基质。比生物分子远远更加灵敏的，活性细胞的固定涉及使用生物相容性材料、温和(良性，benign)合成条件和外部流体支持系统或浸没于缓冲液中，以避免脱水。最常使用的材料为多糖及衍生物、聚合物膜、活性碳以及光聚合树脂。然而，在稳定性与生物相容性方面，这些有机基质显示出若干局限性。

尽管已普遍冷冻保存哺乳动物和微生物培养物，但用于植物细胞的保存方法的受限报告通常的特征在于低的细胞存活力。

实际上，与其它细胞类型相比，由大型有液泡结构组成的植物细胞悬液更趋于严重的低温损伤。植物细胞死亡的主要原因与细胞脱水和与包围细胞器或细胞本身的生物膜的严重损伤相结合的胞外冰形成引发的机械应力有关。另外，当前方法通常需要昂贵的液氮、专用装置来提供可编程的冷却速率以及可能是细胞毒性的高摩尔浓度的冷冻保护剂。由于这些原因，创建冷冻主细胞库(mastercellbanks)需要可替换的程序。

发明目的

本发明的目的在于提供用于冷冻保存或低温保存(植物)细胞、(植物)细胞器和(植物)组织(包括例如，植物愈伤组织、分生组织、芽尖(apices)、芽外植体、胚珠和根)的方法和试剂盒，其不存在现有技术的缺点。