[发明专利]蛋白纯化的新颖方法

说明书

本公开内容提供了用于释放细胞内蛋白的方法。该方法允许从细胞分离感兴趣的蛋白，不需机械破碎细胞、不需从培养基分离细胞且不需从培养基取出细胞。

关于联邦政府资助的研究的声明

本文公开的本发明部分由政府资助做出，且政府在本发明中拥有某些权利。特别地，本文公开的本发明的部分部分地根据美国国立卫生研究院给予的合同号N01-AI-60015C得到资助。

发明领域

本发明总体上涉及从细胞培养物获取细胞内蛋白的新颖方法和试剂。

背景

围绕大规模纯化蛋白的关注对于生物技术产业是日益重要的问题。许多紊乱已是蛋白或酶替代疗法的主题，所述紊乱包括营养不良性大疱性表皮松解症(dystrophicepidermolysis bullosa)和溶酶体贮积紊乱(lysosomal storage disorders)诸如戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry disease)和庞贝氏病(Pompe disease)。供应患者需要的大规模蛋白生产一定是成本敏感的，具有生产效率和出产高质量产品。蛋白纯化的过程是时间漫长的、繁重的和昂贵的。这些缺点大大地影响蛋白替代疗法的成本并通常对医疗保健构成巨大的挑战。

蛋白生产主要在细胞内完成，即，哺乳动物、细菌或真菌，它们通过插入包含用于该蛋白的基因的重组质粒被工程化以产生感兴趣的蛋白。在复合生长培养基中培养表达感兴趣的蛋白的细胞，该复合生长培养基包含通常由动物血清制剂提供的糖、氨基酸和生长因子。纯化需要从供给细胞的化合物和细胞碎片的混合物分离期望的蛋白以便以高质量纯化足够的量用作人类治疗剂。

用于从细胞碎片纯化蛋白的程序是漫长和复杂的。取出感兴趣的蛋白需要的多个和重复的步骤大大地降低最终蛋白的产率和质量。在许多情况下，蛋白在纯化后必须是功能性的。

在生物学表达系统的细胞内区室中表达的重组蛋白在存在细胞壁的情况下通常通过机械破碎从表达系统细胞释放。此类机械方法包括匀浆化、微流化、氮爆、超声和珠搅拌方法。其他方法包括添加酶以部分地降解细胞壁组分随后用渗透剂以诱导周质内含物的破裂和释放。结合酶消化和化学处理的这些方法主要用于在革兰氏阴性细菌中靶向周质间隙的表达的蛋白。没有细胞壁的细胞可通过渗透压而不不添加酶，或通过使用去垢剂或有机溶剂完全破碎细胞膜来破碎。为了提高效率可组合使用破碎方法。

大多数以前的方法仅适用于从周质区室释放蛋白或导致细胞区室完全破碎。当完全破碎细胞时，DNA可从亚细胞区室被释放并导致高粘性液体的形成。DNA可被剪切或酶促降解以降低粘性并使在大规模生产期间处理工艺流体流(the process fluid stream)成为可能。这些步骤成功地用于医药级蛋白的生产；然而，每个处理步骤增加了制造的复杂性，时间和成本。

发明概述

本公开内容提供了新颖方法和试剂，所述新颖方法和试剂涉及从存在于培养基中的细菌细胞特别是大肠杆菌(E.coli)纯化感兴趣的细胞内蛋白的方法，而(i)没有从培养基取出细胞，(ii)不使用细胞的机械破碎或不使用酶降解细胞壁；和(iii)没有将细胞群压实成浓缩的沉淀形式。

所公开的方法用于通过添加透化细胞用于释放重组蛋白的预定组合无机盐和去垢剂来释放细胞内的重组蛋白，而不导致细胞的全部破碎，从而减少DNA释放的量和产生的增加的粘度。

可通过在选择性沉淀后的离心步骤从可溶的重组蛋白纯化出剩余的细胞碎片。

该方法可通过一系列步骤完成，所述步骤包括在完成细胞培养(即，发酵)后将适当的化学试剂添加到生物反应器。以逐步的方式将这些化学试剂添加到培养物。还添加试剂以便实现该试剂的特定浓度。该方法需要化学试剂在溶液中的存在规定的时间量。

该方法不需要从细胞培养物分离细胞。另外，它不需要在添加试剂(“释放试剂”)前除去生长培养基。该方法不利用机械破碎裂解细胞。