[发明专利]蛋白纯化的新颖方法有效
| 申请号： | 201480028322.5 | 申请日： | 2014-03-14 |
| 公开（公告）号： | CN105247036B | 公开（公告）日： | 2019-04-02 |
| 发明（设计）人： | 斯蒂芬·霍利 | 申请（专利权）人： | 安迅生物制药公司 |
| 主分类号： | C12N1/00 | 分类号： | C12N1/00;C12N1/06 |
| 代理公司： | 北京安信方达知识产权代理有限公司 11262 | 代理人： | 郑霞 |
| 地址： | 美国加利*** | 国省代码： | 美国;US |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 蛋白 纯化 新颖 方法 | ||
1.一种用于从表达DAS181的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞释放DAS181的方法，所述方法包括：
(a)提供表达DAS181的细胞的培养物；
(b1)使所述培养物与浓度在10mM至100mM范围内的磷酸钠接触；保持包含添加的磷酸钠的所述培养物至少10分钟；使所述包含添加的磷酸钠的所述培养物与浓度在75mM至200mM范围内的EDTA接触；或
(b2)使所述培养物与浓度在10mM至100mM范围内的磷酸钠和与浓度在75mM至200mM范围内的EDTA接触；
(c)使包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物保持至少10分钟；
(d)将所述包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物的pH调整至范围在5至8的pH；并使所述包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物保持至少15分钟；
(e)使所述包含添加的磷酸钠和添加的EDTA的所述培养物与浓度在5％至8％范围内的Triton X-100和浓度在0.05％至0.20％范围内的SDS接触；
(f)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100和添加的SDS的所述培养物保持至少1小时；
(g)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100和添加的SDS的所述培养物的温度降低；
(h)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100和添加的SDS的所述培养物与0.5％的聚乙烯亚胺接触；
(i)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100、添加的SDS和添加的聚乙烯亚胺的所述培养物保持至少1小时，以及
(j)使所述包含添加的磷酸钠、添加的EDTA、添加的Triton X-100、添加的SDS和添加的聚乙烯亚胺的所述培养物经历除去大部分的细胞碎片的方法，由此提供包含DAS181的组合物；
其中，所述方法不包括(k)机械破碎所述细胞，(l)除去基本上所有的培养基，和(m)添加降解细胞壁材料的酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(c)是至少20分钟。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)是至少30分钟。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)是至少45分钟。
5.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)是至少1小时。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)是在30分钟和1小时之间。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(i)是2-8小时。
8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(g)需要将所述温度降低到低于25℃。
9.如权利要求1所述的方法，其中步骤(h)在20℃-25℃发生。
10.如权利要求1所述的方法，其中步骤(h)在21℃-22℃发生。
11.如权利要求1所述的方法，其中步骤(h)在22℃发生。
12.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括从包含感兴趣的蛋白的组合物纯化感兴趣的蛋白。
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