[发明专利]多重甲基化-特异性扩增系统和方法

说明书

本申请要求于2013年3月14日提交的临时专利申请序列号61/782,370的优先权，该临时专利申请通过引用以其整体结合到本文中。

发明领域

本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基化-特异性扩增系统和方法。

背景

DNA甲基化为可被遗传并随后去除而不改变DNA序列的一种DNA化学修饰。因此，其为表观遗传密码的一部分(Jaenisch&Bird.(2003)NatureGenetics,33,245，通过引用以其整体结合到本文中)。DNA甲基化涉及向DNA核碱基添加甲基。在最常见的例子中，将甲基添加到胞嘧啶嘧啶环的第5个碳。胞嘧啶甲基化通常具有减少基因表达的作用。

甲基化为所有病毒自我/非自我识别的常见能力。所检查的每种脊椎动物中均已发现胞嘧啶5位置的DNA甲基化。在成年体细胞组织中，DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸背景下；非-CpG甲基化在胚胎干细胞中普遍存在(Dodge等(2002)Gene289(1-2):41–48.,Haines等(2001)DevelopmentalBiology240(2):585–598.,通过引用以其整体结合到本文中)。在植物中，胞嘧啶对称(CpG或CpNpG)和不对称(CpNpNp)地甲基化。人的长期记忆存储可通过DNA甲基化调节(Miller&Sweatt.(2007-03-15)Neuron53(6):857–869.,Powell&Devin.(2008)NewScientist.,通过引用以其整体结合到本文中)。

在哺乳动物中，DNA甲基化是正常发育所必不可少的并且与包括印记、X-染色体失活、重复元件和致癌作用的抑制在内的许多关键过程有关。哺乳动物中所有CpG的60-90%为甲基化的(Tucker.(2001)Neuron.30(3):649-52.,通过引用以其整体结合到本文中)。CpG被分为称作“CpG岛”的簇，其存在于许多基因的5’调节区域。在许多疾病过程例如癌症中，基因启动子CpG岛获得异常的超甲基化，这导致可遗传的转录沉默。

用于改善甲基化检测测定的灵敏度和鲁棒性(robustness)的方法是需要的。

发明概述

本发明涉及用于实施多重扩增反应的系统和方法。特别地，本发明涉及多重甲基化-特异性扩增系统和方法。

例如，在一些实施方案中，本发明提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的多个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、2-30、2-20、3-20、3-15、4-20、5-20、6-20、8-20、10-20等)核酸片段以产生多个扩增子；和c)检测所述多个扩增子。在一些实施方案中，所述靶包含CpG岛。在一些实施方案中，所述靶为基因的启动子区域。在一些实施方案中，所述甲基化特异性试剂为亚硫酸氢盐。在一些实施方案中，所述同时扩增在单个反应容器(例如，孔、管等)中进行。在一些实施方案中，所述核酸靶富含GC。在一些实施方案中，亚硫酸氢盐与未甲基化的胞嘧啶残基反应，将其转化为尿嘧啶残基，并且不与甲基化的胞嘧啶残基反应，使其保持为5-甲基胞嘧啶。在一些实施方案中，所述扩增为PCR。在一些实施方案中，所述检测包括使扩增子与多个核酸探针接触。在一些实施方案中，所述核酸探针包含可检测的标记。在一些实施方案中，所有探针包含相同的标记。在一些实施方案中，所述标记为荧光标记，尽管考虑其它标记。在一些实施方案中，所述扩增和检测包括实时PCR扩增和检测。在一些实施方案中，所述检测包括选自，例如，质谱分析、测序或杂交的核酸检测技术。

本发明进一步的实施方案提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的至少5个核酸片段以产生多个扩增子；和c)检测所述多个扩增子。

本发明额外的实施方案提供一种方法，包括：a)用甲基化-特异性检测试剂处理靶核酸；b)同时扩增靶核酸内的至少10个核酸片段以产生多个扩增子；和c)检测所述多个扩增子。

在一些实施方案中，本发明提供扩增核酸的方法，包括：a)同时扩增已经用甲基化-特异性检测试剂处理的靶核酸内的多个核酸片段以产生多个扩增子；和b)检测所述扩增子。