[发明专利]用于稳定包封有活性成分之红细胞的悬浮液的方法、所获得的悬浮液

说明书

用于由掺入活性成分的经重密封RBC获得包封有所述活性成分之红细胞的稳定化悬浮液的方法，所述方法包括将所述经重密封RBC在渗量浓度不低于280mOsmol/kg的孵育溶液中孵育30分钟或更长的时间，所述孵育溶液是不包含使RBC膜变性之试剂的溶液，然后从经孵育悬浮液中除去液体介质并将所获得的RBC悬浮置于允许所述悬浮液被注射到患者中的溶液中。特别地，所得悬浮液的特征在于：在2℃至8℃的温度下在悬浮置于保存液中之后72小时时，细胞外血红蛋白水平维持在0.5g/dl或更低，特别是0.2g/dl或更低，和/或溶血率维持在2％或更低，特别是1％或更低。

本发明涉及用于稳定包封有活性成分之红细胞的悬浮液的方法。本发明还涉及用于制备这样的悬浮液的方法、使用这些悬浮液的处理方法以及包封有活性成分之红细胞的新型稳定悬浮液。

已描述了多种允许将活性成分掺入到红细胞中的方法。在这些方法中，所谓的裂解-重密封技术(lysis-resealing technique)是最普遍的。该技术包括三种变化形式，它们是低渗透析、低渗预膨胀和低渗稀释，所有均基于红细胞内部和外部之间的渗透压差异。这些变化形式的共同之处是以下五个步骤：清洗红细胞残留物并将其在生理缓冲液中离心一次或更多次，使红细胞与低渗液体介质接触导致红细胞膜中的孔打开，活性成分进入红细胞，使用高渗缓冲液使孔关闭(重密封)从而将活性成分封闭在红细胞内，然后将红细胞悬浮置于保存液中。低渗透析法是最有利的并且是工业发展的主题。EP 1 773 452中所述的方法是目前提供了最佳表现的方法，并且具有以下优点：其是可重复的并且提高活性成分的包封产率。

由此获得的产品的稳定性是其在人治疗中使用的关键要素。特别地，当将产品注射到患者中时，产品中包含的细胞外血红蛋白的量必须低于预定阈值。例如，美国食品药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)所要求的细胞外血红蛋白的阈值为在用于人注射之终产品中0.2g/dL或更低。

用现有技术方法获得的产品在其储存期间经历溶血并且在注射之前经历运输。由于大部分脆性红细胞破裂，此溶血使血红蛋白释放到细胞外介质中，结果是在注射这些产品时，其已不再满足FDA的要求。

因此，本发明的一个目的是提出一种方法，使用该方法可提高包封有活性成分的红细胞悬浮液的稳定性。

特别地，本发明的一个目的是提出允许产生红细胞的悬浮液的方法，所述悬浮液掺入活性成分并且在储存后具有稳定的细胞外血红蛋白水平或者与FDA或任何其他健康权威机构提供的推荐保持一致。

本发明的另一个目的是提出适用于包封有活性成分之红细胞的任何悬浮液的所述方法，无论其制备方法，特别是使用裂解-重密封法。

本发明的另一个目的是提出允许产生包封有活性成分之红细胞的悬浮液的所述方法，所述悬浮液是经稳定化的并且具有高细胞产率。

可如下实现这些及其他目的：除去由包封过程(即重密封后)产生的悬浮液中的大部分脆性红细胞以获得包含最大可能比例之抗溶血性红细胞的悬浮液。因此，可将红细胞的悬浮液保存直至将其注射到患者中，其中悬浮液不会经历显著溶血，使其可在注射时获得具有低细胞外血红蛋白水平的悬浮液。因此，本发明的方法提供了大部分脆性红细胞、细胞外血红蛋白和细胞外活性成分的去除。本申请人已成功实现这一点，同时维持良好的细胞产率，在去除大部分脆性红细胞和保留最大数量红细胞之间找到良好折衷。本申请人甚至已能够确定出人意料地使包封有活性成分之红细胞的悬浮液稳定同时提高细胞产率的条件。

“包封”意指活性成分基本上或者完全包含在内部。“基本上”意指小比例的活性成分可另外被捕获在膜中。

“包封有活性成分”意指红细胞掺入具有活性成分功能的分子或者意指由红细胞及其掺入的分子形成的组装物具有活性成分功能。

“孵育溶液”意指在进行孵育步骤期间其中含有包封有活性成分的红细胞的溶液。孵育可在宽血细胞比容范围内，特别是10％至85％血细胞比容内进行。