[发明专利]来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子

说明书

根据本发明，描述了用于生产蛋白质的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，以及使用所述表达方法生产的蛋白质。更特别地，描述了从巴斯德毕赤酵母分离的核酸，其中所述核酸具有启动子活性。本发明还涉及使用巴斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，以及使用所述表达方法生产的蛋白质。

与相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月8日提交的美国临时申请序列号61/774,982的权益，该临时申请通过引用结合到本文中。

公开内容领域

本发明涉及用于生产蛋白质的分离核酸、表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，并且涉及使用所述表达方法生产的蛋白质。更特别地，本发明涉及从巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分离的核酸，其中所述核酸具有启动子活性。本发明还涉及用于使用巴斯德毕赤酵母启动子生产蛋白质的表达方法、宿主细胞、表达载体和DNA构建体，并涉及使用所述表达方法生产的蛋白质。

背景和发明概述

酵母表达系统可用于有效地生产蛋白质，例如酶、激素和疫苗蛋白质，部分上是因为一些酵母迅速生长至高细胞密度，在简单和廉价的培养基中生长，并且为真核生物，因此可以以与哺乳动物中天然蛋白质相似的方式修饰蛋白质。此外，用合适的信号序列，表达的蛋白质可被分泌入培养基中以方便分离和纯化。一些酵母表达系统还为食品和制药工业所接受，因为其对于药物和食物产品的生产是安全的，不像真菌和细菌表达系统，它们可能在一些情况下是不安全的，例如对于人食品制造。

因此，开发或改善可用于表达高水平蛋白质以增加产率、减少蛋白质分离和纯化费用以及降低人和动物健康产品和食物产品的成本的酵母表达系统，对多种工业例如食品和动物饲料工业、人和动物健康工业等是有益的。

已经开发了多种类型的酵母表达系统，包括使用编码同源或异源蛋白质的核酸在酵母启动子控制下的诱导性或组成型蛋白质表达。启动子为连接编码蛋白质的核酸的5’末端的调节元件，并且可与宿主细胞(例如，酵母宿主细胞)中的多种调节因子相互作用以控制RNA从DNA转录。启动子还可控制RNA从DNA转录的时机。例如，在酵母的巴斯德毕赤酵母中已经鉴定出AOX1启动子，并通常用于酵母表达系统中，因为其为紧密调节的强启动子。

由于酵母表达系统对包括人类制药工业以及人食品和动物饲料工业在内的多种工业的重要性，酵母表达系统的改善为许多研究和开发的焦点。因此，本发明人从巴斯德毕赤酵母中鉴定了对用于蛋白质在酵母中表达特别有效的启动子。本文所述启动子可用在例如用于蛋白质组成型表达的表达系统中。

在本发明一个说明性实施方案中，提供了一种分离核酸，其中所述分离核酸的序列包含例如与选自本文所述的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列具有至少90%、95%或98%同一性，或与其片段具有至少90%、95%或98%同一性的序列，其中所述分离核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。在其它实施方案中，提供包含这些启动子序列的表达载体、宿主细胞和DNA构建体。

在另一个实施方案中，提供使用这些启动子序列生产蛋白质的方法。所述方法包括在培养基中培养含有包含与编码蛋白质的异源编码序列操作性连接的任何上述启动子序列的第一表达盒的宿主细胞的步骤，其中所述培养在允许该蛋白质表达的条件下进行。在另一个说明性实施方案中，提供根据该方法生产的分离蛋白质。

下列条款清单中描述的所有实施方案也被考虑为按照本发明使用。对于下列条款中所述的所有实施方案，认为实施方案的任何可应用的组合均与本发明一致。

1. 一种分离核酸，其中所述分离核酸的序列包含与选自SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2的序列具有至少90%同一性或与其片段具有至少90%同一性的序列，其中所述分离核酸包含组成型巴斯德毕赤酵母启动子序列。