[发明专利]用于转染的脂质纳米粒子和相关方法

说明书

相关申请的交叉引用本申请要求2013年3月15日提交的美国专利申请号61/798495的权益，所述文献通过引用的方式明确地完整并入本文。

关于序列表的声明

本申请附带的序列表以文本格式提供替代纸质副本并且因而通过引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是43935_Sequence_Final_2014-03-14.txt。该文本文件为748比特；创建于2014年3月14日；并且通过EFS网提交，同时提交本说明书。

背景技术

在含水介质中分散时，脂质容易地形成脂质体，如单层小泡和多层小泡。脂质体已经成功地用于包封并向细胞递送广泛类型的化学物质，包括核酸、蛋白质和小分子药物。

从阳离子脂质和磷脂的组合物制备的阳离子脂质体容易地与阴离子大分子如DNA和RNA形成聚集物。这些阳离子脂质体–核酸聚集物经常如此工程化，从而复合物的净电荷为正，据信这促进与阴离子性细胞表面相互作用，因而增强摄取包封的载货和后续细胞转染。常用于体外转染细胞的阳离子脂质组合物的例子是以1:1摩尔比与二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)组合的N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)。

阳离子脂质体–核酸聚集物的大小和结构取决于脂质组成和制造方法。这些结构物可以具有数百纳米至微米的大小并且通过电子显微术可视化时，经常具有不均一的形态，包括经典的“意大利粉和肉丸”构象。

阳离子脂质体–核酸聚集物在原代细胞(即从活生物收获的细胞)中具有有限的有效性。认为这种是过多阳离子电荷所致毒性的结果。毒性外加大粒度还限制了阳离子脂质体–核酸聚集物用于体内转染的用途。

脂质纳米粒子(LNP)是临床上最先进的药物递送系统，7种基于LNP的药物已经收到监管批文。这些批准的药物含有小分子如抗癌药物并且与“游离药物”相比，显示有效性改进和/或毒性降低。LNP载体技术还已经用来递送“遗传”阴离子大分子如质粒用于蛋白质表达或小干扰性RNA(siRNA)寡核苷酸(OGN)用于基因沉默。

用来包封和递送基因药物的LNP技术和阳离子脂质的最新进展已经能够在静脉内(i.v.)注射之后产生这样的siRNA-LNP，其中已经显示所述siRNA-LNP克服阳离子脂质体-核酸聚集物的固有不稳定性并在难以转染的原代细胞和动物模型(包括非人灵长类)中介导治疗性相关靶基因的沉默。这些siRNA-LNP目前在几项临床试验中接收评价。

已经开发多种方法以配制含有基因药物的LNP系统。这些方法包括将预制LNP与OGN在乙醇存在下混合，或将溶解于乙醇中的脂质与含有OGN的含水介质混合，并产生直径100nm或更小及OGN包封效率为65-95％的LNP。这两种方法均依赖于阳离子脂质的存在以实现OGN包封并依赖聚(乙二醇))(PEG)脂质的存在以抑制聚集和庞大结构物的形成。所产生的LNP系统的特性，包括大小和OGN包封效率，对多种配制参数如离子强度、脂质和乙醇浓度、pH、OGN浓度和混合速率敏感。通常而言，使用当前配制方法时，参数如混合时的相对脂质浓度和OGN浓度以及混合速率难以控制，在制品内部和制品之间导致产生的LNP的特征变异。

微流体装置以纳升规模快速混合流体，同时精确控制温度、停留时间和溶质浓度。受控和快速的微流体混合先前已经应用于无机纳米粒子和微粒子的合成，并且可能在大规模生产纳米粒子优于大规模系统。微流体双相液滴技术已经用来产生用于药物递送的单分散体聚合性微粒子或用来产生用于包封细胞、蛋白质或其他生物分子的大型小泡。已经展示使用流体动力流速聚焦法(一项常见微流体技术)引起试剂快速混合，以产生大小受控的单分散体脂质体。还已经证明这项技术可用于其中获得更小更多单分散体粒子的聚合物纳米粒子生产，与大量生产方法相比，包封小分子更多。

尽管许多产品可用于细胞转染，但是需要在体外向难以转染的原代细胞以及在体内向靶细胞有效递送siRNAOGN和其他阴离子大分子的装置和方法。本发明寻求满足这种需求并提供其他相关优点以解决这样的主要问题，所述主要问题妨碍了验证通过病态细胞基因组测序鉴定的异常基因作为潜在的药物靶或生物标记物靶。

发明概述

在一个方面，本发明提供一种包含脂质和表面活性剂的转染试剂组合物。

在一个实施方案中，该转染试剂包含(a)一种或多种阳离子脂质、(b)一种或多种第二脂质和(c)一种或多种固醇；以及(d)一种或多种表面活性剂。