[发明专利]肝母细胞样细胞的培养方法及其培养物

说明书

技术领域

本发明涉及肝母细胞样细胞的培养方法及其培养物，其中，该肝母细胞样细胞是在从诱导性多能干细胞(iPS细胞：inducedpluripotentstemcells)或胚胎干细胞(ES细胞：embryonicstemcells)等多能干细胞(PSC：pluripotentstemcells)向肝细胞分化诱导的过程中生成。

本申请要求通过参照援引于此的日本专利申请特愿2013-080557号的优先权。

背景技术

所谓的多能干细胞是指具有多分化潜能和自我更新能力的未分化细胞，并且，已知多能干细胞具有组织损伤后的组织修复能力。因此，多能干细胞在各种疾病的治疗用物质的筛选、再生医疗领域中很有用，其研究日益活跃。多能干细胞中的iPS细胞是通过在成纤维细胞等体细胞中导入特定的转录因子、例如OCT3/4、SOX2、KLF4、C-MYC等基因，将体细胞去分化(dedifferentiate)而制成的诱导性多能干细胞。从理论上来说，具有多分化潜能性(pluripotency)的细胞能够分化诱导为包括肝脏等在内的所有组织或器官。

作为从多能干细胞向肝细胞分化诱导的方法，主要尝试了形成细胞团块(拟胚体)、在培养基中添加体液因子、或者选择使用适当的细胞外基质(extracellularmatrix)、饲养细胞、基质胶等的方法等。但是，有报告称通过上述方法得到的肝细胞的药物代谢酶活性低(非专利文献1～3)。在从干细胞向成熟肝细胞分化时，需要从干细胞起经过中内胚层、内胚层细胞、肝母细胞的分化工序。在各个分化工序中，在培养体系中使用激活素(activin)A、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF：basicFibroblastGrowthFactor)、BMP4(bonemorphogeneticprotein4：骨形态发生蛋白4)、FGF-4、视黄酸或者DMSO(二甲基亚砜)等的体液因子或化合物。另外，有报告称肝脏发育需要HEX、HNF4α、HNF6、FOXA2等转录因子(非专利文献4)。

关于使用新一代基因治疗用载体系统有效地从ES细胞或iPS细胞等干细胞向肝细胞分化诱导时的基因导入方法已被公开(专利文献4)。专利文献4中公开了下述内容，即：通过使用腺病毒载体(adenovirusvector)，在ES细胞或iPS细胞等干细胞中导入从例如HEX基因、HNF4α基因、HNF6基因以及SOX17基因中选择的任意一种或多种基因，能够使干细胞有效地分化诱导为肝细胞。如上所述，针对有效地从ES细胞或iPS细胞等多能干细胞分化诱导为肝细胞的方法进行了各种研究。

关于人多能干细胞的培养，公开了一种包被有人层粘连蛋白α5β1γ1(人层粘连蛋白511)的E8片段或人层粘连蛋白α3β2γ2(人层粘连蛋白322)的E8片段的细胞培养用基材(专利文献5)。专利文献5中公开的是在无饲养层的培养环境下，将多能干细胞以保持其多分化潜能性的状态进行培养。但是，在专利文献5中，虽然已公开了人多能干细胞的培养，但不存在任何关于肝母细胞样细胞等组织干细胞、分化诱导中间细胞的培养细胞的记载，上述细胞培养用基材的应用仅限于未分化的人多能干细胞。

【现有技术文献】

【专利文献】

专利文献1：日本公报、特开2002-272480号(日本专利、特许第3635462号公报)

专利文献2：日本公报、特开2003-250566号

专利文献3：日本公报、特开2008-136381号

专利文献4：国际公开WO2011/052504号小册子

专利文献5：日本公报、特开2011-78370号

【非专利文献】

非专利文献1：Hepatology.51，297-305[2010]

非专利文献2：PLoSOne.6，e24228[2011]

非专利文献3：Hepatology.55，1193-203[2012]

非专利文献4：NatureReviewsGenetics.3，499-512[2002]

发明内容

本发明的课题在于提供一种稳定地对从多能干细胞向肝细胞分化诱导的过程中生成的“肝母细胞样细胞”进行维持培养的方法。进而，本发明的课题在于提供一种通过上述培养方法而得到的培养物。