[发明专利]肝母细胞样细胞的培养方法及其培养物

权利要求书

1.一种肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，包括：

使从多能干细胞向肝细胞分化诱导的过程中生成的肝母细胞样细胞与层粘连蛋白接触的工序，和

在使所述细胞与层粘连蛋白接触后，将未粘附在层粘连蛋白上的细胞除去的工序。

2.如权利要求1所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，

与从多能干细胞向肝细胞分化诱导的过程中生成的肝母细胞样细胞接触的所述层粘连蛋白，是层粘连蛋白同种型中的、由层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α4β1γ1以及层粘连蛋白α5β1γ1构成的层粘连蛋白亚型以外的其他层粘连蛋白。

3.如权利要求1所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，

与从多能干细胞向肝细胞分化诱导的过程中生成的肝母细胞样细胞接触的所述层粘连蛋白，是由具有相对于整合素α6β1的亲和性比相对于整合素α3β1的亲和性强这一性质的同种型构成的层粘连蛋白。

4.如权利要求1～3中任一项所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，

与从多能干细胞向肝细胞分化诱导的过程中生成的肝母细胞样细胞接触的所述层粘连蛋白是层粘连蛋白α1β1γ1的一部分或全部。

5.如权利要求4所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，

所述层粘连蛋白α1β1γ1的一部分中至少包含层粘连蛋白α1β1γ1的E8片段。

6.如权利要求1～5中任一项所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，

所述肝母细胞样细胞是源自诱导性多能干细胞和/或提取的胚胎干细胞的肝母细胞样细胞。

7.如权利要求6所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，包括以下工序，即：

1)将源自诱导性多能干细胞和/或提取的胚胎干细胞的肝母细胞样细胞，接种至包被有层粘连蛋白的细胞培养用固相载体上的工序；

2)在接种有所述细胞的细胞培养用固相载体上，将未粘附细胞从所述固相载体除去的工序；

3)将在所述工序2)中粘附在所述固相载体上的细胞在层粘连蛋白上进行培养的工序。

8.如权利要求7所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，还包括以下工序，即：

4)将通过权利要求7所述的工序1)～3)培养得到的肝母细胞样细胞，从细胞培养用固相载体上分离，并使其悬浮在培养基中的工序；

5)将悬浮的所述细胞，以细胞数为2.5×10²个/cm²～1.25×10⁵个/cm²、优选细胞数为2.5×10³个/cm²～2.5×10⁴个/cm²、更优选细胞数为2×10⁴个/cm²～2.5×10⁴个/cm²的状态接种至包被有层粘连蛋白的细胞培养用固相载体上的工序；

6)将在所述工序5)中粘附在所述固相载体上的细胞在层粘连蛋白上进行培养的工序。

9.如权利要求8所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，

将权利要求8所述的工序4)～6)反复进行至少一次以上。

10.如权利要求7～9中任一项所述的肝母细胞样细胞的培养方法，其特征在于，

在权利要求7的工序1)所述的将细胞接种至包被有层粘连蛋白的细胞培养用固相载体上的工序之前，将源自诱导性多能干细胞和/或提取的胚胎干细胞的肝母细胞样细胞分散成单细胞，并且将分散后的肝母细胞样细胞接种至工序1)的包被有层粘连蛋白的细胞培养用固相载体上。

11.一种肝母细胞样细胞的实质上纯粹的培养物，其特征在于，

所述肝母细胞样细胞是相对于层粘连蛋白同种型中的层粘连蛋白α1β1γ1的粘附能力比相对于层粘连蛋白α2β1γ1、层粘连蛋白α4β1γ1以及层粘连蛋白α5β1γ1的粘附能力强的细胞。

12.一种肝母细胞样细胞的实质上纯粹的培养物，其特征在于，

细胞表达从ALB、CK19、CK7、CYP3A7中选择的任意一种或一种以上的肝母细胞标记物，并且表达整合素α6和整合素β1。