[发明专利]甲基化DNA的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种甲基化DNA的检测方法。更详细而言，本发明涉及一种将用亚硫酸氢盐处理了的DNA进行PCR扩增，将其产物通过离子交换色谱进行分析的迅速且简便的甲基化DNA的检测方法。

背景技术

近年，已认识到表观遗传学参与各种生命现象，与其解析相关的研究正在积极进行。尤其是，已阐明DNA的异常甲基化深度参与癌症化而受到关注。作为癌细胞中的特征性的表观遗传异常，已知部分基因启动子区域中的CpG岛的异常DNA甲基化。CpG岛是介由磷酸二酯键(p)的胞嘧啶(C)-鸟嘌呤(G)的2碱基序列高频出现的区域，其多存在于基因上游的启动子区域。CpG岛的异常DNA甲基化通过癌抑制基因的失活等来参与癌变。CDKN2A、CDH1、MLH1、RB、BRCA1、TSLC1、RUNX3等各种癌抑制基因由于启动子区域存在的CpG岛的异常甲基化导致失活从而诱发癌化。DNA被甲基化时，由于该DNA甲基化在细胞分裂时被复制，由子细胞继承，因此癌抑制基因因异常甲基化而失活时，癌抑制基因失活的状态会持续。

作为已经确立的甲基化DNA的解析方法，有利用亚硫酸氢盐(重亚硫酸盐、bisulfite)反应的方法。该方法是甲基化DNA解析中最通用的方法。用亚硫酸氢盐处理单链DNA时，胞嘧啶经过磺化、水解脱氨化、脱磺化，被变换为尿嘧啶。另一方面，被甲基化的胞嘧啶，由于最初发生的磺化的反应速度极慢，因此在实际进行的亚硫酸氢盐处理的反应时间中仍保持为甲基化胞嘧啶。因此，使用亚硫酸氢盐处理了的DNA进行PCR(Polymerase Chain Reaction)时，甲基化胞嘧啶仍为胞嘧啶，但是非甲基化胞嘧啶由尿嘧啶被置换为胸腺嘧啶而被扩增。利用该PCR扩增产物的序列中产生的胞嘧啶和胸腺嘧啶的碱基差异，解析甲基化状态。将其作为基本原理而通用的方法是专利文献1、非专利文献1记载的Methylation-Specific PCR(MSP)法和非专利文献2、3记载的Combined Bisulfite Restriction Analysis(COBRA)法。

MSP法是在DNA的亚硫酸氢盐处理后，依次进行使用了甲基化序列特异引物和非甲基化序列特异引物的PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，通过两个引物所致的扩增产物的有无来判定对象区域的DNA甲基化状态的方法。COBRA法是在DNA的亚硫酸氢盐处理后，依次进行使用甲基化DNA和非甲基化DNA共同的引物的PCR扩增、使用识别甲基化DNA和非甲基化DNA中序列不同的位置的限制性内切酶的处理、琼脂糖凝胶电泳，通过限制性内切酶处理片段的有无来判定对象区域的DNA甲基化状态的方法。两种方法从在没有特别的装置的情况下能够进行甲基化DNA的定量解析的方面来看均是目前广泛使用的方法，但是存在在解析中使用电泳法这点上需要花费劳动和时间的课题。

另一方面，在生物化学、医学等领域中的核酸、蛋白质、多糖类等生物高分子的分离分析中，作为简便且短时间能够精度良好地检测的方法，通用的是离子交换色谱。离子交换色谱是利用柱填充剂的离子交换基团和测定对象物质中的离子性基团之间发生的静电相互作用而分离测定对象物质的方法，包括利用阴离子交换的离子交换色谱和利用阳离子交换的离子交换色谱。阴离子交换色谱使用具有阳离子性官能团作为离子交换基团的柱填充剂，能够分离阴离子性物质。此外，阳离子交换色谱使用具有阴离子性官能团作为离子交换基团的柱填充剂，能够分离阳离子性物质。

使用离子交换色谱分离核酸的PCR扩增产物时，通常使用利用核酸分子中含有的磷酸的负电荷进行分离的阴离子交换色谱。作为阴离子交换色谱中的柱填充剂的阳离子性官能团，包括二乙基氨基乙基这样的弱阳离子性基团、季铵基这样的强阳离子性基团。填充有含有这些阳离子性的官能团作为离子交换基团的柱填充剂的色谱柱已经市售，在多个研究领域中使用。

此外本发明人报告了作为离子交换色谱用柱填充剂，开发了含有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两种基团作为柱填充剂的阳离子性官能团的柱填充剂，通过使用了填充有该填充剂的柱的离子交换色谱，分离分析了20mer的非甲基化合成寡聚核苷酸间的单碱基的差异(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:美国专利第5786146号公报

专利文献2:国际公开公报第2012/108516号小册子

非专利文献

非专利文献1:Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，9821-9826(1996)