[发明专利]肽聚糖的生物学测定

说明书

本发明涉及一种用于测定样品、特别是葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖(PGN)的生物学方法。该PGN测定包括：a)通过声处理、加热和/或碱性化处理该葡萄糖聚合物样品；b)使处理后的样品或其稀释物与重组细胞接触，该重组细胞表达外源TLR2(Toll样受体2)和直接依赖与该TLR2相关的信号传导路径的报道基因。该报道基因编码有色或荧光蛋白质或编码其活性可用或不用底物来测量的蛋白质；c)测量该报道基因信号；和d)使用PGN的量与该报道基因信号强度之间的关联性的标准曲线来确定该样品中PGN的量。

发明领域

本发明涉及一种样品、具体地葡萄糖聚合物样品中的肽聚糖的测定。

发明背景

无菌性炎症性发病是在使用用于治疗性目的(例如：腹膜透析，肠外营养，通过静脉途径注射)的制品治疗期间观察到的主要并发症。尽管这些炎症性发病中的一些与化学性质问题相关(化学污染物的意外存在或某些化合物的不适当剂量)，但大多数病例是由于在制造工艺期间释放的微生物来源的污染物的存在所致。现已明确确认，脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是主要污染物，在其以痕量水平存在于制品中时，其呈现触发所述炎症性发病的高风险。

许多质量控制实验室以常规方式使用LAL(鲎(Limulus)阿米巴样细胞溶解物)测定来检测并测定LPS污染。这种测定是基于通过从鲎(Limulus))鲎(horseshoe crab))血淋巴提取的感测复合物对内毒素的识别。

目前提出同样基于无脊椎动物血淋巴的提取物的反应性的其他测定用于检测用于治疗性应用的产品中的PGN(SLP-Wako，易默奈公司(Immunetics))。然而，这些测定具有并非极具特异性的缺点，因为其也与其他微生物来源的分子(例如β-葡聚糖)反应。此外，这些方法需要购买用于这个用途的特殊设备，一般会增加成本并因此限制这些测定技术的获得。

此外，LPS和PGN具有根据其细菌来源可变的结构，从而导致炎症反应性出现巨大差异。这就是为什么另外需要以标准分子的当量单位表达这些测定的结果的原因(例如，该LAL测定中大肠杆菌(E.coli)的LPS)。

此外，这些分子最常以大分子复合物形式存在，这会影响其溶解性以及其炎症潜能。例如，PGN的大小高度可变并且经常与细胞壁中的其他分子(例如脂磷壁酸和脂肽)聚集。

因此，已研发出只考虑与这些分子相关的炎症负荷的“生物学”方法。炎症反应的效应细胞具有用于识别感染源特异性产生的分子结构的特定感测器。这些称为PAMP(病原体相关分子模式分子)的分子基本上由TLR(Toll样受体)和NLR(Nod样受体)识别，所述受体的特异性与不同种类的炎症分子的分子结构相关。与LPS(其为由TLR4型受体识别的配体)相反，PGN是由TLR2型受体识别的配体。

近年来，已研发出活体外细胞测定来替代炎症反应的动物模型。这些测定大多是基于在被污染产品的存在下培育单核细胞以及基于炎症性细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、RANTES)的产生的反向滴定。然而，使用从血液分离的原代细胞的测定经受供体的显著个体间差异性，此可导致实验偏差。

与此相比，单核细胞细胞系给出恒定反应，这解释了为什么其一般偏好原代细胞。然而，这些细胞系也并非完全令人满意。例如，细胞因子的选择经常被批评，因为大多数细胞因子是瞬时表达并且其在培养基中的浓度并非始终反映炎症分子的真实负荷。由于所有这些单核细胞都表达大部分的TLR/NLR，所以基于其使用的测定对一种类型的污染物无选择性，但将给出一个总体炎症反应。

此外，由于这些细胞对不同炎症分子的敏感性差异而产生严重问题。因此，TLR2配体PGN的反应性远小于LPS，从而使得通过这些方法难以对其进行检测。事实上，LPS在ng/mL级的浓度下诱导显著反应，而获得类似反应需要的PGN浓度要高100倍(w/w比率)。