[发明专利]用于提高PCR准确度的试剂

权利要求书

1.一种聚合酶链反应(PCR)扩增反应混合物，除了在PCR反应缓冲液中的至少一条包含至少一个靶序列的核酸链、至少一对引物、DNA聚合酶和dNTP’s外，其还包含

至少一种由一对能够形成50-800 nM浓度的6-30个碱基对长、解链温度(Tm)至少32℃并且完全杂交的双链杂交体的互补寡核苷酸组成的添加试剂，所述双链杂交体具有包含相互作用的、共价连接的标记部分的末端，在一条链上为庞大的非平面荧光部分，以及在另一条链上为庞大的非平面荧光部分或非-庞大的平面部分，

其中所述至少一种试剂的两条链均不用作反应中所扩增的模板链上的探针或引物，和

其中所述双链杂交体的浓度足以增强聚合酶选择性；

其中所述庞大的非平面荧光部分为荧光团并且其中所述非-庞大的平面部分为非-荧光猝灭剂，

其中所述反应混合物为LATE-PCR反应混合物。

2.权利要求1所述的反应混合物，其中所述庞大的非荧光部分连接到所述链之一的5’-末端核苷酸。

3.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述试剂的双链杂交体为平端的并且标记部分连接到平端的末端核苷酸。

4.权利要求1所述的反应混合物，其中所述至少一种试剂的猝灭剂-标记链以等于或大于互补链浓度的浓度加入。

5.权利要求1所述的反应混合物，其中所述至少一种试剂的猝灭剂-标记链以大于互补链浓度的1.5-10倍的浓度加入。

6.权利要求1所述的反应混合物，其中所述至少一种试剂的猝灭剂-标记链以大于互补链浓度的2-5倍的浓度加入。

7.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述标记通过接触猝灭相互作用。

8.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述双链杂交体的另一个末端包含至少一个dabcyl标记。

9.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述至少一种双链寡核苷酸试剂包含计算Tm彼此相差至少10℃的两种双链寡核苷酸试剂。

10.权利要求9所述的反应混合物，其中所述两种双链寡核苷酸试剂共用一条共有寡核苷酸链。

11.权利要求1所述的反应混合物，其中至少所述试剂的至少一个双链寡核苷酸由天然核苷酸组成。

12.权利要求11所述的反应混合物，其中所述至少一种双链寡核苷酸试剂为DNA。

13.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述DNA聚合酶为热启动聚合酶。

14.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述至少一个核酸靶序列为RNA，并且所述反应混合物包含反转录酶。

15.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述反应混合物包含荧光dsDNA染料。

16.权利要求1或2所述的反应混合物，其中所述反应混合物包含至少一种能够与所述扩增的靶序列杂交并发射信号的荧光标记探针。

17.权利要求1或2所述的反应混合物，其中聚合酶选择性以下列方式中的至少一种来表现：错误引发抑制；偏好完美互补引物-靶杂交体而不利于具有未完美互补的凹陷3’末端序列的杂交体的引物特异性增加；偏好具有富含GC的凹陷3’末端序列的引物-靶杂交体而不利于具有富含AT的凹陷3’末端序列的杂交体的聚合酶选择性增加；产物进化抑制；和重复反应之间的分散减少。