[发明专利]用于标记和分析样品的方法和组合物

说明书

本发明涉及标记样品中的分析物的方法。

交叉引用

本申请要求申请日为2013年3月15日的美国临时申请No.61/801785和申请日为2013年3月28日的美国临时申请No.61/806143的优先权，这两个申请的全文内容都通过引用并入本申请。

背景技术

对生物样品中的核苷酸和蛋白质的分析是分子生物学领域的基本内容。检测、鉴别和利用遗传学和蛋白质组学信息的能力使得能进行灵敏性和特异性诊断以及治疗。

提供本发明以在单一细胞水平快速标记和分析核苷酸和蛋白质。

发明内容

本发明提供了标记靶寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)将DNA分入多个区室(compartment)中；(b)在区室内进行DNA的体外转录反应，从而获得含有RNA的区室；(c)使含有RNA的区室内部(interior)与含有靶寡核苷酸的成组的区室内部合并；(d)使RNA与靶寡核苷酸进行杂交；以及(e)进行反应，以将对应RNA的序列附接到靶寡核苷酸。

在一些实施例中，DNA是双链的。

在一些实施例中，区室是油和水乳剂内的液滴(droplet)。

在一些实施例中，靶寡核苷酸包括至少一个包含细胞标记和分子标记的靶寡核苷酸。

在一些实施例中，靶寡核苷酸为DNA。

在一些实施例中，所述方法可以进一步包括以下步骤：在步骤(c)的合并前，将靶寡核苷酸分到成组的区室中。

在一些实施例中，所述的方法可以进一步包括以下步骤：在步骤(c)的合并前，将成组的细胞分到各区室并且使细胞裂解，以释放细胞寡核苷酸。例如，细胞寡核苷酸为靶核苷酸。替代地，细胞寡核苷酸是细胞mRNA。

在一些实施例中，所述的方法可以进一步包括以下步骤：进行细胞mRNA的反向转录，以生成细胞cDNA。

例如，所述的反向转录反应利用对基因组区有特异性的引物执行。所述的基因组区域可以是免疫球蛋白基因或T细胞受体基因。

例如，所述的反向转录反应可以在合并步骤前在成组的区室内进行。

替代地，所述的反向转录反应可以在合并后的区室内进行。

在一些实施例中，靶核苷酸是细胞cDNA。

在一些实施例中，反应为cDNA末端快速扩增(RACE)反应。

在一些实施例中，DNA与固相支持物偶联。例如，固相支持物为磁珠(bead)。

本发明还提供一种方法，其包括以下步骤：(a)提供多个包含多个DNA寡核苷酸的磁珠；(b)提供多个含引物序列、通用序列、接头(adapter)序列和细胞标记的DNA寡核苷酸；(c)将步骤(a)中的磁珠与步骤(b)中的寡核苷酸融入多个区室，使得每个区室含有单个的磁珠和单个的寡核苷酸；(d)在区室内，进行寡核苷酸的扩增反应，从而获得多个包含RNA所述引物序列、通用序列、接头序列和细胞标记的DNA寡核苷酸；(e)进行在区室内的体外DNA的转录反应，从而获得含有引物序列、通用序列和细胞标记的区室；(f)将含有RNA的区室内部与含有靶核苷酸的成组的区室内部合并；(g)使RNA与靶寡核苷酸杂交；和(h)进行反应，以将相应的RNA的序列附接到靶核苷酸。

在一些实施例中，磁珠上的多个寡核苷酸包括分子标记。

本发明进一步提供标记靶寡核苷酸的方法，其包括以下步骤：(a)从包含多种细胞类型的生物样品中分离多个mRNA；以及(b)采用靶核苷酸的特异性引物和含有分子标记、通用序列和接头序列的模板切换寡核苷酸，进行mRNA的反向转录，以生成标记靶cDNA。