[发明专利]蛋白酶在中性粒细胞胞外诱捕网中的底物性质

说明书

优先权声明

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请序列号No.61/799,658的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。

发明领域

本申请涉及中性粒细胞胞外诱捕网，也称为NET。

背景

中性粒细胞是血浆中丰度最高的白细胞。其是针对病原体侵袭产生的应答首先募集至损伤部位的细胞，并且其是先天性免疫防御的第一道防线。传统上将中性粒细胞认为是炎性应答和急性免疫的效应细胞，其通过胞内吞噬作用发挥功能，并且使用裂解蛋白酶、活性氧(ROS)和杀微生物蛋白用于攻击感染剂。最近的研究表明，中性粒细胞还能够通过表达用于与其他免疫细胞，如树突状细胞、B细胞和T细胞传递信号的细胞因子、趋化因子、Fc受体和补体成分具有免疫调节能力(Mantovani,Cassatella等，2011)。

蛋白酶是中性粒细胞重要的效应器。其不仅具有直接的杀微生物活性，还在趋化因子、细胞因子和受体的蛋白水解过程中发挥作用(Pham2006；Meyer-Hoffert和Wiedow2010)。这种调节活性由IL-1β和IL-18经由NE、PR3和CG不依赖于半胱天冬酶的活化(Robertson,Young等，2006；Guma,Ronacher等，2009；Joosten,Netea等，2009)或抗炎性颗粒蛋白前体经由NE和PR3转化为促炎性颗粒体蛋白(Kenssenbrock,2008)所示例。而且，已发现NE在中性粒细胞胞外诱捕网(NET)中通过裂解组织因子通路抑制剂将中性粒细胞介导的炎症与凝血通路偶联。

NET由在称为NETosis的特定形式的细胞死亡中受到刺激的中性粒细释放。据推测NETosis代表了针对病原体侵袭产生的应答由中性粒细胞介导的先天性免疫的一种新机制。(Brinkmann,Reichard等，2004；Remijsen,Kuijpers等，2011)。其特征为形成NET，一种由解聚的染色质、抗微生物蛋白和肽形成的网络。NETosis的作用是先天性免疫防御的第一道防线，其代表了在多个方面与凋亡和坏死截然不同的一种新的细胞死亡模式。未观察到核碎裂或膜出泡，并且其活化不依赖于半胱天冬酶的活化，但是其需要NADPH氧化酶和MAPK激酶通路。NETosis还参与NE、髓过氧化物酶和肽基精氨酸脱亚胺基酶4(一种负责组蛋白瓜氨酸化和染色质解聚的酶)的活性(Wang,Li等，2009；Papayannopoulos,Metzler等，2010)。据推测NET的主要功能是诱捕和杀灭病原体。此外，其还提供了用于随后进行的先天性和适应性免疫应答的具有较高的局部效应器和介质浓度的基质。此前进行的NET成分的蛋白质组学研究鉴定出了三种主要的蛋白酶，分别将其称为中性粒细胞NE、CG和PR3(Urban,Ermert等，2009)。

为了以无偏见的方式表征与NET相关的蛋白水解活性，使NET中诱捕的蛋白释放并通过利用质谱测定其多重底物性质(MSP-MS)的方法对其进行测定(O'Donoghue等，2012)。这种方法在使用串联的液相色谱-质谱的多重检测中利用具有124个高多样性肽的文库对裂解位点进行检测。使用MSP-MS测定，通过将底物特异性性质与纯化的人中性粒细胞蛋白酶进行比较阐明在复杂NETosis样品中各种酶的作用。此外，使用四肽荧光底物文库研究NE、CG、PR3和NSP4非优势方的底物特异性。据申请人所知，本申请报道了在相同条件下平行地比较NE、PR3、CG和NSP4的扩展的底物特异性的首次完整的研究。通过对来自三个独立的健康供体的NET相关蛋白酶的分析显示，可以将其主要活性归功于NE。NE活性的免疫耗竭显示了PR3和较低程度的CG贡献的活性，以及微弱的NSP4活性。对底物特异性以及各种NET相关蛋白酶对总的NET相关活性贡献的鉴定能够导致在急性和慢性免疫疾病中针对病理性NETosis的改进的治疗性干预的发展。

附图简述

下述附图构成了本申请说明书的一部分并且包括其以便进一步显示本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个以及结合本申请特定实施方式的详细描述可以更好地理解本发明。

图1描述了显示对中性粒细胞丝氨酸蛋白酶非优势方的特异性进行比较的图(上面一行：组织蛋白酶G(100nM)、中间一行：蛋白酶3(50nM)、下面一行：弹性蛋白酶(50nM))。