[发明专利]融合免疫调节蛋白及其制备方法

权利要求书

1.一种制备具有双特异结合活性的治疗活性融合蛋白的方法，其中所述融合蛋白包含肿瘤靶向部分和至少一个免疫调节部分，所述免疫调节部分削弱癌细胞的免疫耐受性，其中所述肿瘤靶向部分是结合至CTLA-4或EGFR1的抗体，并且其中通过以下步骤制备所述融合蛋白：

制备编码所述融合蛋白的密码子优化的核苷酸序列以在CHO细胞中表达，其中所述密码子优化的核苷酸序列被修饰为增加了CG序列；并且其中所述密码子优化的核苷酸序列对于结合至EGFR1的抗体来说是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，或者对于结合至CTLA-4的抗体来说是SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，以及对于所述免疫调节部分来说是SEQ ID NO：3或7；其中结合至EGFR1或CTLA-4的抗体的重链的所述密码子优化的核苷酸序列SEQ ID NO：1或5缺失用于表达在所述抗体的重链C末端的赖氨酸的核苷酸；

在能够瞬时或稳定表达的CHO细胞中克隆所述融合蛋白的所述优化的序列；

在适合生长的条件下在介质中生长所述CHO细胞，并允许所述CHO细胞表达所述融合蛋白；以及

收集分泌的融合蛋白且任选地进一步纯化。

2.权利要求1的方法，其中所述免疫调节部分直接或通过由SEQ ID NO：4表达的连接子连接至所述抗体的重链的N或C末端、所述抗体的轻链的N或C末端或这两种链的N和C末端两者。

3.权利要求1的方法，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、4和7。

4.权利要求1的方法，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、3和4。

5.权利要求1的方法，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含SEQ ID NO：5、6、3和4。

6.一种包含同源的治疗活性融合蛋白的制剂，其中所述融合蛋白包含肿瘤靶向部分和至少一个免疫调节部分，其中所述肿瘤靶向部分是结合至CTLA-4或EGFR1的抗体，并且其中通过权利要求1的方法制备所述融合蛋白。

7.一种载体，所述载体包含优化的基因的核酸序列，其中所述优化的基因已经被修饰为增加了CG序列，其中所述载体包括用于编码至少一个靶向部分、至少一个免疫调节部分和连接部分的核苷酸序列，其中所述优化的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1-7。

8.权利要求7的载体，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、4和7。

9.权利要求7的载体，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：1、2、3和4。

10.权利要求7的载体，其中所述核苷酸序列包含SEQ ID NO：5、6、3和4。

11.通过权利要求1的方法制备的治疗活性融合蛋白在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的应用，其中所述融合蛋白包含肿瘤靶向部分和至少一个免疫调节部分，其中所述肿瘤靶向部分是结合至CTLA-4或EGFR1的抗体。

12.权利要求11的应用，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：15、17、27或29的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：9的氨基酸序列。

13.权利要求11的应用，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：16、18、28或30的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：8的氨基酸序列。

14.权利要求11的应用，其中所述融合蛋白包含SEQ ID NO：28或30的氨基酸序列，以及SEQ ID NO：31的氨基酸序列。