[发明专利]生产腺病毒的方法

说明书

本公开涉及用于制造某些腺病毒的方法以及由此获得的病毒产品，所述腺病毒例如嵌合型腺病毒，特别是复制型腺病毒。

背景

目前，制药领域正处于意识到病毒作为供人类使用的疗法的潜力的边缘。迄今为止，衍生自ONXY-15(ONYX制药，已被上海三维生物技术收购)的病毒已在数量有限的国家获批准用于头颈癌。然而，当前有许多处于临床的病毒，这些中的一些应当有希望获得注册应用于人类。

许多病毒疗法都基于腺病毒，例如ColoAd1是当前临床试验治疗结直肠癌的嵌合型溶瘤腺病毒(WO2005/118825)。

这些基于腺病毒的治疗剂需要以这样的数量被制造，即适合于支持临床试验并满足注册后的需求且在符合良好制造规范(GMP)的条件下。

作为制造方法的一部分，病毒在哺乳动物细胞中体外增殖，例如，在细胞悬浮培养物中。病毒通过细胞裂解从这些细胞中回收并随后纯化。图1摘自Kamen&Henry2004(JGeneMed.6:pages184-192)，显示涉及GMP级腺病毒制造方法的示意图。明显地，病毒复制之后，细胞被裂解。

裂解之后来自细胞的污染DNA是值得注意的问题，且必须尽可能从治疗腺病毒产品中去除。这详细描述于申请WO2011/045381中，其中描述了裂解细胞，使细胞悬液中的DNA片段化或沉淀，并利用切向流澄清。图1中的第三个步骤还示出用DNAse消化DNA。

腺病毒GMP制造领域中的许多工作针对Ad5实施。现有技术显示，对于批式法，感染后大约40小时达到最大病毒滴度，之后开始出现细胞死亡。此外，对病毒感染力降低的关注通常通过保持任何GMP方法中最低保持处理时间来解决，所述病毒感染力是所生产病毒活性的度量。

简而言之，开发成功的重组腺病毒方法需要详细了解基本的宿主细胞系生理学和代谢；重组病毒以及细胞系与病毒之间的关系。基本上，方法需要根据病毒或病毒载体的具体类型而调整。

本发明人令人吃惊地建立了通过这样的方法来制备嵌合型溶瘤腺病毒，所述方法从细胞培养基中分离病毒并避免裂解细胞的必要性，因而显著减少病毒产品中DNA污染的初始水平。

发明概述

因而，本公开提供了用于制造具有包含E2B区的基因组的嵌合型溶瘤腺病毒的方法，其中所述E2B区包含来自第一种腺病毒血清型的核酸序列和来自第二种不同的腺病毒血清型的核酸序列；其中所述第一种和第二种血清型各自独立地选自腺病毒亚群B、C、D、E或F，其中所述方法包括以下步骤：

a.在适合于供养细胞的培养基存在下，培养用腺病毒感染的哺乳动物细胞使得所述病毒复制，其中所述细胞能够支持病毒复制，以及

b.在培养期结束时，通过过滤从步骤a)的培养基中分离腺病毒，其中所述病毒的分离不在细胞裂解步骤之后。

还提供的是用于制造具有B亚群的纤突和六邻体的腺病毒(例如Ad11，特别是Ad11p，又被称为Slobitski毒株)的方法，其中所述E4区的一部分被删除，所述方法包括以下步骤：

a.在适合于供养细胞的培养基存在下，培养用腺病毒感染的哺乳动物细胞使得所述病毒复制，其中所述细胞能够支持病毒复制，以及

b.在培养期结束时，通过过滤从步骤a)的培养基中分离所述病毒，其中所述病毒的分离不在细胞裂解步骤之后。

在一实施方案中，所述病毒为复制型或复制缺陷型。

在一实施方案中，所述腺病毒已删除部分或全部E3区。

本发明人还令人吃惊地发现，所述方法可成功地扩展至野生型Ad11病毒，例如Ad11p，还可扩展至具有来自Ad11的纤突和六邻体的病毒，包括Ad11p。

附图简述

图1为摘自Kamen和Henry2004(JGeneMed.6:S184-192)的示出涉及GMP级腺病毒制造方法的示意图。

图2示出以MOI10感染的HEK293悬液的与细胞和上清液(SN)相关的感染ColoAdl颗粒的比例。

图3示出以MOI10(感染复数10)感染的贴壁HEK293的与细胞和上清液(SN)相关的感染ColoAdl颗粒的比例。

图4示出测试感染条件下HEK293悬浮培养物的病毒颗粒总量。

图5可视化ColoAdl感染的HEK293细胞在感染后40小时，46小时和70小时的细胞裂解液(裂解液)或上清液(SN)中的细胞和病毒DNA。