[发明专利]对WT1mRNA的表达量进行定量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种对人WT1的mRNA的表达量进行定量的新方法，该方法可用于对白血病、实体癌等癌症的诊断和对骨髓移植时期的确定。

背景技术

肾母细胞瘤-1(Wilms tumor gene-1，以下称为“WT1”。)基因是于1990年被Call等人鉴定为小儿肾母细胞瘤的致病基因的基因(非专利文献1)。此后，还有报道显示WT1 mRNA不仅在小儿肾母细胞瘤中高水平表达，而且在实体癌细胞株(例如胃癌细胞株、大肠癌细胞株、肺癌细胞株及乳癌细胞株)等实体癌细胞中也高水平表达(非专利文献2)。目前认为，WT1基因是不仅与小儿肾母细胞瘤有关、并且还与多种癌症有关的癌相关基因。

Call等人报道了WT1 mRNA在白血病细胞株K562细胞及CCRF-CEM细胞中的表达(参见非专利文献1)，Miwa等人报道称，经Northern印迹分析发现，在22例急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia，以下称为“AML”。)中的15例中有WT1 mRNA的表达(非专利文献3)。另外，Inoue等人报道称，在AML的初诊时在100％(45/45)的病例中均观察到WT1 mRNA表达。此外，还有报道称：诊断时的WT1 mRNA表达量与预后有关(非专利文献5)；即使通过治疗使得WT1 mRNA表达量一度转为阴性，但在复发时其将再度升高(非专利文献6)；并且，复发时的WT1 mRNA表达量较之诊断时的表达量有所增加(非专利文献7)。

如上所述，鉴于WT1基因以单一基因的形式在AML患者中高频度出现，以及通过治疗转为阴性后、在复发时再度升高等事实， WT1基因因可在AML的治疗中用作为微小残留病灶(minimal residual disease，以下亦称为“MRD”)的监测标志物，故而一直以来已作为体外诊断用医药品而被贩售。

作为人WT1 mRNA的测定方法，以往已知有以β-肌动蛋白为基准的竞争定量法(专利文献1)。但是，该测定方法不仅需要将WT1mRNA与β-肌动蛋白的mRNA分开测定，而且还必须进行所谓的两步式RT-PCR法(在逆转录反应完成后再进行延伸反应)，因此非常耗费时间。

此外，作为另一种测定人WT1 mRNA的方法，专利文献2公开了针对WT1 mRNA的一步式RT-PCR法。但是，在该方法中，需要另行测定持家基因表达量(其用于对WT1基因表达量进行校正)，因此较为繁杂。

专利文献

专利文献1：日本特开平11-89599号公报

专利文献2：日本特开平11-89596号公报

非专利文献

非专利文献1：Call,K.M.et al.,Cell 1990；60:509-520.

非专利文献2：Jpn.J.Cancer Res.1999；90:194-204.

非专利文献3：Miwa,H.,et al.,Leukemia 1992；6:405-409.

非专利文献4：Inoue,K.,et al.,Blood,1994,84(9),3071-3079.

非专利文献5：Blood 1997；90:1217-1225.

非专利文献6：Blood 1996；88:2267-2278.

非专利文献7：Blood 1996；88:4396-4398.

发明内容

如前所述，作为对WT1基因表达量进行定量的方法，已知的方法存在需要大量时间且较为繁杂的问题，需要开发出能够简便地在短时间内对人WT1基因表达量进行定量的方法。因此，本发明的目 的在于，提供一种能够简便地且在短时间内对WT1 mRNA进行定量的新方法。特别地，本发明的目的在于，通过同时对人WT1 mRNA和持家基因两者的表达量进行定量，提供能够简便地在短时间内对WT1 mRNA进行定量的新方法。

本申请的发明人为解决上述课题而进行了锐意研究，结果发现，通过使作为目的基因的WT1基因(mRNA)和作为校正用基因的持家基因(mRNA)的逆转录反应及延伸反应同时且于同一容器内连续进行(一步法)，可以简便地且在短时间内对作为目标的人WT1mRNA的表达量进行定量。并且，本申请的发明人确认了通过使用该一步式RT-PCR法，能够以比两步式RT-PCR法(其中分开对目的基因和校正基因进行扩增)更为简便的方式、并且在与两步式RT-PCR法几乎为同等程度的短时间内以更高的灵敏度检测出目的基因。