[发明专利]对从染色的FFPET切片显微切割的材料的RT‑qPCR分析

说明书

发明背景

本描述涉及用于经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片的免疫组织化学染色的方法，其包括以下步骤：a)提供固体支持物，b)将经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片封固(mount)到固体支持物上，c)自经福尔马林固定的、经石蜡包埋的组织切片除去石蜡，d)于50至70℃加热固体支持物上封固的组织切片达12至24小时以修复(retrieve)表位，并e)染色固体支持物上封固的组织切片，其中至少步骤e)在存在0.5至3.0M氯化钠的情况中实施。本描述进一步涉及用于实施所述方法的试剂盒。

福尔马林固定和石蜡包埋(FFPE)是一种用于在临床常规中供诊断组织学和长期贮存用的组织固定的公知规程。使用FFPE组织(FFPET)样品的大型档案进行生物标志物发现研究及早期临床研究。此外，可以使用FFPET样品分离RNA，所述RNA可以在基因表达分析中进一步应用。虽然来自FFPET样品的RNA显示高度降解，但是它对于RT-qPCR分析仍然是足够的，只要使用足够量的材料进行RNA分离。可以使用此类分析来产生第一生物标志物假设并仅进行假设测试(Lohmann等,Methods.2013Jan；59(1))。

为了能够自FFPE组织切片分离血管和肿瘤细胞巢并实施RT-qPCR分析，我们组合下述技术：免疫组织化学染色后自FFPET的激光捕捉显微切割(laser capture micro-dissection,LCM)与cDNA的预扩增后的RT-qPCR分析。

技术人员在组合自经IHC染色的FFPET切片的LCM，接着进行RT-qPCR分析时面对的挑战是LCM后非常有限量的材料、样品组织固定后的RNA降解和另外免疫组织学染色规程期间的RNA降解。经典的染色规程包括表位修复(例如于98℃的HIER方案)和与不能在无RNA酶条件下生成的缓冲液(抗体溶液、清洗缓冲液、染料)的温育时间。若RNA意图在RT-qPCR分析中使用，则与LCM后非常有限量的材料组合的所描述RNA降解是此工作流的主要问题。RNA降解导致LCM后基因表达分析(例如感兴趣生物标志物和参照基因之间的比率)中不可靠的结果。mRNA稳定性是基因特异性的，并且因此它们在以不同程度降解，导致用于基因表达分析的相对定量的错误结果。

为了克服此RNA降解问题，已经建立了不同规程以使降解保持为最小值。例如，大多数出版物使用新鲜冷冻(Fresh Frozen,FF)组织，其在用于RT-qPCR分析时具有较少降解过程的优点。然而，主要的缺点是与FFPET相比FF组织是一种很大程度上有限来源的实情(Buckanovich等.,Cancer Biol Ther.2006Jun；5(6):635-42；Gjerdrum等.,Diagn Mol Pathol 2004(13),p.224–233)。经常难以获得足够量的FF组织来实施产生统计学显著结果的研究。此外，可用于回顾测试的临床样品材料通常是FFPET。

因此，此领域中的主要焦点是开发使RNA降解最小化的与LCM和RT-qPCR分析组合使用FFPET的技术。开发出用于FFPET切片的超快染色规程以使染色期间的RNA降解最小化。然而，分析来自此类显微切割的超快染色的FFPET切片的RNA显示了在以非常短的温育期(2次5分钟)抗体温育后，与简单组织染剂(苏木精)相比仍有约90％RNA被降解(Gjerdrum等.,Diagn Mol Pathol 2004(13))。另外，超快染色方案不适用于所有抗体，因为一些需要几小时至过夜温育(Brown等,RNA Journal 2009(15),p.2364-2374)。此类长期温育规程导致大量RNA降解，从而基因表达分析是简直不可能的。

因此，本说明书的目的是提供用于随后为RNA分离使用的FFPET切片的改善的染色技术，其中改善的染色技术导致对于RNA分析(诸如基因表达分析)足够的自FFPET切片分离的RNA的产量(yield)和质量。

发明概述

发现了对固体支持物上封固的组织切片应用的本文中描述的染色方法中0.5至3.0M氯化钠的高盐浓度阻止随后自组织切片分离的RNA的降解。根据描述的方法适合于染色规程，其中在染色后分离RNA且其中需要高质量RNA，诸如用于基因表达分析。