[实用新型]复合式丛枝菌根真菌分室培养装置

说明书

技术领域

本实用新型涉及特殊微生物的培养技术领域，尤其涉及复合式丛枝菌根真菌分室培养装置。

背景技术

自1842年N?geli首次对丛枝菌根（arbuscular mycorrhizae，AM）进行描述以来，菌根学家已经对AM真菌的分类、形态结构、生理特征、生态分布、功能多样性等进行了广泛研究。目前，围绕丛枝菌根的研究已经在以下几个方面得到证实：地球上80%的陆生高等植物根系可以与AM真菌共生形成丛枝菌根共生体。参与形成丛枝菌根结构的真菌是一类起源、演化相对独立的特殊真菌。AM真菌可以促进宿主植物提高对矿质营养和水分的吸收，促进植物体的生长和提高植物体的生物量，改进产品品质，增强对生物胁迫和非生物胁迫的抗性和耐受能力，如干旱、盐渍、重金属污染、病害、虫害等，从而有利于植物的生长发育。参与形成丛枝菌根的AM真菌与宿主植物之间没有严格的宿主专一性，同一种AM真菌可以通过延伸到土壤中的根外菌丝在同种或异种植物的根系之间形成“菌丝桥”结构，通过该结构，可以在同种或异种植物之间进行物质和信息的传递，因而AM真菌在植物群落的结构、组成、演替和生态系统稳定性等方面具有重要的功能。但是，由于AM真菌是一类专性活体营养微生物，虽然可以进行无性繁殖或有性繁殖，但迄今为止尚不能在离体条件下进行纯培养，AM真菌离开宿主植物即无法正常生长、发育，不能独立完成其生活史，只能依赖与活体宿主植物共生完成其繁殖过程。因此，AM真菌的纯培养已经成为AM真菌研究的瓶颈，对AM真菌的分类鉴定、菌剂生产和应用推广是一个重要的限制因素。

目前，由于化学肥料和杀真菌剂的广泛使用，在园林、苗圃等人工干扰强烈的土壤中，AM真菌的生态学功能受到了广泛抑制。菌根生物技术在农业、园艺和林业中至今没有得到普遍应用，AM真菌在生物多样性保护、受损生态系统恢复及可持续发展中的功能没有得到充分发挥，究其原因是由于缺乏大规模生产AM 真菌接种剂的方法。因此，无论是环境保护，还是生态治理的要求，获得纯种AM真菌孢子及其根外菌丝都具有极其重要的生态学意义。因为AM真菌的分类与鉴定、生物多样性、生理特征、分子生态学、系统学及种内、种间关系等方面的研究工作均依赖于获得纯化的真菌菌株，且生产商业化的接种剂需要高密度和高纯度的真菌繁殖体。目前，世界各国都在积极开展AM真菌无菌培养方法的研究，已经设计完成以下7种培养方法开展相关研究工作：⑴AM真菌繁殖体以孢子、根外菌丝体、分离的泡囊、菌根根段或被侵染根系等多种形式存在，而盆栽培养法获得的是这些繁殖体的混合菌剂。迄今为止，来自AM真菌——植物盆栽培养的根段和孢子仍然是最广泛和最可靠的菌剂。对于盆栽培养方法，盆栽基质是繁殖菌种和培养宿主植物的载体，是盆栽培养能否成功最关键的影响因素之一。其次是盆栽基质颗粒的大小、基质的酸碱度等。盆栽培养法最大的缺点是在开展接种剂的生产时，需要足够的空间和较长的时间，而且生产出来的接种剂繁殖体数量少、容积大、笨重、不便于携带或运输。随着研究的深入，虽然AM真菌的扩繁技术在不断的改进，但盆栽培养法仍然不能满足科研和商业生产的需要，因为盆栽培养法采用敞开式培养，很容易受到污染。基于此，目前围绕AM真菌的无菌人工培养基培养方法已经成为关注的热点之一。⑵1962年，Mosse最早在无菌条件下的人工培养基上建立了AM真菌的培养体系。1975年，Mosse & Hepper又采用不同的宿主植物重复了上述试验。但是，培养基培养法只能获得少量纯度较高的接种物，只能用于菌根生理生化、分子生物学等方法的科学研究，缺乏大规模生产的可行性。⑶1981年，Crush & Hay设计了静止营养液培养法，利用白车轴草（Trifolium repens）在灭菌的营养液中培养珠状巨胞囊霉（Gigaspora margarita）。但这种方法需要特定的培养装置，成本较高，实际应用中具有较大的局限性。后来，又设计出一种近于半水培的静止营养液培养法，此方法在以烟草为宿主植物的条件下，在侵染率、产孢量、节省培育时间和空间等方面都优于盆栽法，但是，由于宿主植物生长在透气保水的灭菌河沙中，培养的接种剂虽然质量较高，但产量较低，仅可用于科研或生产上小面积的应用。⑷1984年，Elmes & Mosse、Mosse & Thompson分别以玉米和菜豆等作为宿主植物，研究AM真菌菌剂的营养液流动培养技术。该方法可以用于工厂化生产AM 真菌菌剂，尽管没有了土壤微生物的污染，但由于根系长期浸泡在液体中，因而不利于根系和真菌的呼吸，对菌剂的繁殖速度和质量仍然有一定的影响。⑸1988年，Hung & Sylvia设计了工厂化生产AM 真菌菌剂的汽雾培养系统，将预接种5%~10%的宿主植物架设在空中，再用架设在根系周围的喷头每隔数秒钟对根系进行喷雾营养液，保持根系100%的湿度，以满足根系对水分和营养的需求。总体而言，雾化培养系统对营养液要求的参数较多，尤其是对P和pH值的控制十分严格，操作复杂，成本较高。⑹AM真菌的离体双重无菌培养技术，这是一种比较前沿且最接近于纯培养的AM真菌培养技术。该培养技术又可以分为：AM真菌与普通植物根器官双重培养技术和AM真菌与Ri T-DNA转型根的双重单胞无菌培养技术。其中，AM真菌与普通植物根器官双重培养技术，目前已经采用苜蓿（Medicago sativa）离体根、红车轴草（Trifolium pratense）离体根、番茄（Lycopersicon esculentum）离体根、白车轴草（Trifolium repens）离体根、绿豆（Phaseolus aureus）离体根，发现以上所有离体根器官可以与AM真菌建立双重培养体系，而且获得了新一代的孢子，但并不可以连续的继代培养。此后，随着分子生物学的迅猛发展，人们又建立了AM真菌与转型Ri T-DNA胡萝卜根器官双重培养体系，该培养方法中菌根共生体由Ri T-DNA转型的宿主植物根器官和菌根真菌在培养基中建立。丛枝菌根由开放式培养体系转入实验室的培养皿中，从而尽可能地避免外源污染，此方法也可以连续继代培养产生孢子和菌根根段。但研究表明第3代孢子和菌根根段的侵染率均明显下降，说明在无菌条件下，培养AM真菌是可能的，但是其后代将逐渐丧失侵染性。⑺1995年Redecker et al.利用北葱（Allium schoenoprasum）和根内球囊霉（Glomus intraradices）建立了AM共生体，设计了AM真菌的玻璃珠分室培养法，获得了AM真菌纯净体，可用于PCR和RFLP研究，没有发现污染迹象。玻璃珠分室培养法的最大优点就是真菌和基质易于分离，可以培养出大量纯净的AM真菌，特殊的培养装置可以有效免除生长基质对真菌的污染，收获的菌剂生物量大，菌剂较纯净，该方法也为AM真菌分子生物学、生理生化、遗传学等研究提供了一条简便易行的获得少量AM真菌纯净菌剂的途径。而且在专利号为CN1354252A的“以玻璃珠为培养基质的AM真菌的培养”中，主要涉及一种使用特定培养装置及培养介质的AM真菌的培养方法，该方法表明对于产孢能力强的AM真菌地表球囊霉（Glomus versiforme）在真菌生长室中可以获得多至20 mg干重的菌体，每盆获得的孢子数以万计。但是该培养系统技术含量高，操作复杂，仅可用于科学研究和小规模接种剂的生产使用，而且菌根和分支菌丝均为向地性生长，所以该装置会限制菌根和分支菌丝的生长。