[发明专利]鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗及其引物和应用

说明书

技术领域

本发明涉及动物疫苗制造技术领域，具体涉及一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)及其引物和应用。

背景技术

核酸疫苗具有安全性高、在机体内维持时间长、制备简单等优点，已引起广泛关注。核酸疫苗，就是把外源基因克隆到真核质粒表达载体上，然后将重组的质粒DNA直接注射到动物体内，使外源基因在活体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，引发免疫反应。

目前国内外有多个学者利用鸡球虫抗原基因构建的核酸疫苗进行免疫，均证明其可产生保护作用。Kopko等将E.tenella折光体蛋白基因插入pcDNA3.1载体中获得表达质粒pcDNA3-SO7，免疫后观察到了明显的保护作用。说明球虫保护性抗原的真核表达质粒免疫可产生保护作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)及其引物和应用，用于保护鸡群。本发明首次将Hsp90基因插入真核载体中构建质粒并将其作为预防鸡堆型艾美耳球虫的核酸疫苗，该核酸疫苗制备简单，省时省力，成本低，稳定性好。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

1、一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)，序列如序列表Seq No.1所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种用于构建鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的引物对，上引物P1：如序列表Seq No.2所示，下引物P2：如序列表Seq No.3所示。

2、如上所述的一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)在治疗和/或预防鸡球虫的药物中的应用。

3、一种鸡堆型艾美耳球虫基因重组疫苗(pVAX1-Hsp90)的构建方法，包括如下步骤：

(1)根据现有质粒pMD18-T-Hsp90的核苷酸序列设计引物对，上引物，序列如序列表Seq No.2所示，下引物如序列表Seq No.3所示；

(2)进行常规链式聚合酶反应扩增Hsp90基因；

(3)构建重组质粒pVAX1-Hsp90。

4、如上所述的构建方法，步骤(2)采用常规链式聚合酶反应的具体步骤如下：将混合液在94℃预变性5min，然后进入下列循环：94℃、30s，59.2℃、30s，72℃、2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，扩增完毕后置4℃终止反应；

所述混合液组成如下所示：

5、如上所述的构建方法，步骤(3)质粒pVAX1-Hsp90的重组构建方法具体步骤如下：用限制性内切酶BamH I和Pst I酶切消化PCR所得Hsp90基因产物和pVAX1载体，分别获得Hsp90基因片段和线性载体pVAX1，将所得片段胶回收后进行体外连接，构建重组质粒pVAX1-Hsp90，将疑似阳性的质粒送华大基因测序，将测序鉴定为阳性的重组质粒命名为pVAX1-Hsp90。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：(1)本试验首次将Hsp90基因插入真核载体中构建质粒并将其作为预防鸡堆型艾美耳球虫的核酸疫苗。(2)该核酸疫苗制备简单，省时省力，成本低，稳定性好。(3)研究表明，核酸疫苗在疾病的防治中具有其他疫苗不可比拟的优点，因此该核酸疫苗有望在鸡堆型艾美耳球虫的防治中发挥重要作用。

附图说明

图1是Hsp90基因PCR图；

其中，M：DNAmarker；1：Hsp90基因扩增结果；

图2是重组质粒pVAX1-Hsp90的构建示意图；

图3是重组质粒pVAX1-Hsp90的BamH I单酶切及BamH I和Pst I双酶切鉴定图；

其中，M：DNA marker；1：重组质粒BamH I单酶切鉴定2：重组质粒BamH I和Pst I双酶切鉴定；

图4是免疫雏鸡胸腺T细胞数量变化图；

图5是免疫雏鸡脾脏T细胞数量变化图；

图6是免疫雏鸡外周血T细胞数量变化图；

图7是免疫雏鸡外周血Hsp90 IgG抗体含量动态变化图；

图8是免疫雏鸡增重情况；

图9是免疫雏鸡攻虫后第6天克粪便卵囊数；

图10是免疫雏鸡攻虫后第6天十二指肠病变计分。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述：

实施例1