[发明专利]提取茶叶核酸的试剂及用该试剂提取茶叶核酸的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，更具体地说，涉及一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶DNA和RNA的试剂及使用该试剂提取茶叶DNA和RNA的提取方法。

背景技术

优良品种的茶树都是长期精心选育而成的，传统的茶树品种的鉴定是根据其物理特性(例如芽叶肥瘦、大小、叶色、叶片厚薄等)和鲜叶化学成分进行鉴别。随着分子诊断技术的发展，使聚合酶链式反应(PCR)、探针杂交、核酸测序等分子生物学方法直接检测茶树和茶叶的遗传特性和基因表达情况成为可能。通过对茶叶DNA的检测可以判断茶叶遗传特性，而对茶叶RNA的检测，可以判断茶叶的基因表达情况，以推测茶叶的性状。利用遗传背景相同的茶叶，在不同地域或接受不同培养方法，其生长情况会发生变化，茶叶性状也发生变化。分子诊断技术的第一步就是模板核酸的制备，即样品中核酸的提取，这直接影响着检测的结果。

茶叶中含有的次生代谢物质最为复杂，特别是对DNA提取影响极大的多酚类物质在茶叶中的含量是所有植物中最高的，因此，茶叶样品中核酸的提取和纯化一直是耗时，繁琐的过程。虽然目前有分别提取茶叶DNA和RNA的方法，但是这些方法的原理和操作过程各不相同，没有一个公认的可以同时对茶叶的DNA和RNA进行高效的共同提取的方法。

众所周知，茶叶由于细胞壁比较难以破裂，因此在其核酸提取(尤其是RNA)方面，效果一直不很理想。目前茶叶的核酸提取主要采用裂解细胞后提取核酸的方法，其中常用的破壁方法主要包括：超声研磨，加入表面活性剂或变性剂，以及一些提取试剂盒等。目前被广泛采用的市场销售的RNA提取试剂盒价格昂贵，操作步骤繁琐，并且提取效果也并不理想。因此，如何从茶叶中高效、快捷的共同提取DNA和RNA核酸，已成为了目前分子诊断技术等技术在茶叶品种、品质鉴定领域中应用的一个瓶颈。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的多酚类物质影响茶叶破壁及RNA的提取的缺陷，提供一种破除茶叶细胞壁，提取茶叶DNA和RNA的试剂及使用该试剂提取茶叶DNA和RNA的提取方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种提取茶叶核酸的试剂，包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D；

其中，试剂A包括Tris、EDTA、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸、十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇以及作为溶剂的水；其中Tris的浓度为5-10mM；EDTA的浓度为5-10mM；3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸的体积百分含量浓度为0.05％-0.2％、十二烷基肌氨酸钠体积百分含量浓度为0.05％-0.2％；β-巯基乙醇的体积百分含量浓度为0.1-0.5％；

试剂B包括水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇；水饱和酚、吡咯烷酮、乙醇的体积比为(99-98):1:1；

试剂C包括氯仿和异戊醇；氯仿和异戊醇的体积比为25:1；

试剂D为无水乙醇。

本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂A的pH值为7.2-7.8。

本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂B的pH值为5-8。

本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂A按照如下方法制备：将十二烷基肌氨酸钠、β-巯基乙醇、Tris、EDTA、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸和水混合，得到试剂A。

本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂B按照如下方法制备：将水饱和酚、乙醇、吡咯烷酮混合，得到试剂B。

本发明所述的提取茶叶核酸的试剂，其中，所述试剂C按照如下方法制备：将氯仿和异戊醇混合，得到试剂C。

本发明还包括一种茶叶核酸的提取方法，利用上述的提取茶叶核酸的试剂进行提取，包括如下步骤：

S1、茶叶的研磨：将茶叶磨碎得到茶叶粉末；

S2、去除茶叶的细胞壁，得到去细胞壁的茶叶裂解液：使用试剂A与茶叶粉末混匀，再加入试剂B，混匀，进行裂解反应，得到反应液；将反应液离心收集上层水相，即得到去除细胞壁的茶叶裂解液；

S3、纯化去细胞壁的茶叶裂解液：在去除细胞壁的茶叶裂解液中加入等体积的试剂C，进行纯化反应，得到纯化裂解液；

S4、得到茶叶的DNA和RNA：在纯化裂解液中加入等体积的试剂D，混匀，离心得到茶叶细胞内的DNA和RNA。

本发明所述的茶叶核酸的提取方法，其中，所述茶叶、试剂A和试剂B的配比为1μg-1g：400μl：400μl。

本发明所述的茶叶核酸的提取方法，其中，S2中所述的裂解反应时间为30-60min。