[发明专利]一种从地龙中提取的CAT酶

说明书

技术领域

本发明涉及具有生物活性的酶，具体涉及一种从地龙中提取的CAT酶。

背景技术

CAT酶，即过氧化氢酶，是催化过氧化氢分解成氧和水的酶，存在于细胞的过氧化物体内。CAT酶是过氧化物酶体的标志酶,约占过氧化物酶体酶总量的40％。CAT酶存在于所有已知的动物的各个组织中，特别在肝脏中以高浓度存在。

地龙，是一味传统的中药材，在我国传统医药中有着悠久的应用历史，因其作为药物的安全性好，且具有良好的抗氧化功能，是一种提取CAT酶的理想原料。专利文献CN101570743A公开了一种以地龙为原料制备的复合多酶及其制备方法，该复合多酶中包含CAT酶；其制备方法以地龙为材料,通过缓冲液低温保护匀浆,离心分离,洗涤,加硫酸铵沉淀分离,透析去除SO^2-₄，分子筛层析,超滤浓缩、低温真空干燥即得；纯化制备的复合多酶,在生物大分子分解、底物利用方面,具有高效、多功能的特点。经比较研究，现有技术提供的从地龙中提取CAT酶的工艺仍存在产能有限、过程耗时长、效率低等一系列缺陷，且透析去除SO^2-₄的过程会在一定程度上影响CAT酶的纯度及活性。

发明内容

本发明旨在克服现有技术存在的缺陷，提供一种从地龙中提取的高活性CAT酶。

本发明以地龙作为提取CAT酶的原料，地龙具有易于养殖、来源广泛、生物安全性高的特点；并且地龙中CAT酶含量较高，适于规模化生产CAT酶。

本发明提供了一种从地龙中提取的CAT酶(过氧化氢酶)，所述CAT酶由包括以下步骤的方法制备而成：

1)将地龙浸泡于pH4.8～5.2的0.015～0.025mol/L柠檬酸缓冲液中，分散成匀浆液，离心后取上清，即得粗酶液；

2)将硫酸铵加入步骤1)所得粗酶液中，静置，离心后收集沉淀；

3)将步骤2)所得沉淀溶解于pH7.0～7.4的0.01～0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，将所得溶液加入平衡好的葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25顶端，用本步骤所述磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质且不含硫酸铵的洗脱液，浓缩，得浓缩液；

4)在步骤3)所得浓缩液中加入NaCl，得到NaCl浓度为0.4～0.6mol/L的溶液，将所得溶液加入平衡好的金属螯合亲和柱顶端，用pH 5.8～6.2的0.015～0.025mol/L磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集含有蛋白质的洗脱液，浓缩，冷冻干燥，即得CAT酶。

本发明所述步骤1)中：所述地龙为市售的中药材地龙；所述柠檬酸缓冲液的浓度优选为0.02mol/L，pH值优选为5.0；地龙与柠檬酸缓冲液的质量体积比为1：1～20，优选为1：3～5，此处地龙的质量单位为g，柠檬酸缓冲液的体积单位为ml；将地龙分散成匀浆液的设备选用常规的高速剪切机，高速剪切机的操作温度为-5～20℃，优选为0～4℃，转速为300～12000rpm，优选为6000～8000rpm，剪切时间为0.5～20min，优选为3～10min；所述离心的温度为-5～20℃，优选为0～4℃，离心速度为300～12000rpm，优选为1000～5000rpm，离心时间为0.5～20min，优选为5～15min。

本发明所述步骤2)需要进行两次硫酸铵沉淀，具体为：将硫酸铵以质量体积比0.3～0.5:1溶解于步骤2)所得粗酶液中，此处硫酸铵的质量单位为g，粗酶液的体积单位为ml，静置20～40min，在0～4℃、7500～8500rpm条件下离心10～20min，分离上清液，收集沉淀；在所得上清液中以质量体积比0.7～0.9:1加入硫酸铵，此处硫酸铵的质量单位为g，上清液的体积单位为ml，静置20～40min，在0～4℃、8500～9500rpm条件下离心25～35min，收集沉淀；合并两次收集所得的沉淀。

本发明所述步骤3)采用葡聚糖凝胶柱Sephadex G-25对酶溶液进行纯化，凝胶柱的平衡和流动相的洗脱均为常规操作；所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液；缓冲液的浓度优选为0.015mol/L，pH值优选为7.2；步骤3)所得沉淀以质量体积比1:1～5溶解于磷酸盐缓冲液中，此处沉淀的质量单位为g，磷酸盐缓冲液体积的单位为ml；所述浓缩优选为聚乙二醇浓缩法，所述聚乙二醇优选为PEG4000，浓缩步骤为常规操作。该步骤能快速获得不含硫酸铵的蛋白溶液，避免了常规透析除盐方法可能造成的目标产物损失和繁冗过程。